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Taqman探针法——原理 5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针 Taqman探针法是高度特异的PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′-5′外切酶活性，切断探针，产生荧光信号，由于探针与模板是特异性结合的，所以荧光信号的强弱，代表了模板的数量。 多重Taqman荧光定量PCR在报告基团的选择中不同探针不能选择相同或者相近波长报告基团 ABI7500检测光谱通道 Taqman探针法——工作机理 热变性 引物和探针与模板退火 延伸反应 探针 报告基团 淬灭基团 探针 DNA聚合酶 引物 R R R R 高度特异性 重复性好 灵敏度高 可进行多重定量 优 点 只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针 缺 点 Taqman探针法——优缺点 方法 优点 缺点 SYBR Green I 方法 引物价格低廉，不需要进行特殊处理， 适用性广 灵敏度高 引物要求高，非特异扩增或者是引物二聚体影响结果。 一个反应只能对一个基因进行检测 TaqMan 方法 重复性好 特异性高 可进行多重PCR 引物二聚体不影响结果 探针合成价格高昂，且必须找专业公司合成 两种方法的对比 荧光定量PCR定义及数学原理 荧光定量PCR的两种主要标记方法（化学原理） 荧光定量PCR解析方法 定量PCR注意事项及常见问题 ?绝对定量(Absolute Quantification，AQ) ?相对定量(Relative Quantification，RQ) 绝对定量与相对定量的定义 绝对定量通过标准品定量 绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。 标准样品的种类： ?含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 ?含有和待测样品相同扩增片段的cDNA ?PCR的产物 绝对定量：从荧光到拷贝数 标准曲线评价 评价标准曲线： 扩增效率(E) ---90%-110% 相关系数(R2) ---大于0.98 平行管重复性 ---SD小于0.167 扩增效率 扩增效率与标准曲线的斜率相关，计算方程为：扩增效率（E）＝10-1/斜率。理论上，在每个指数扩增循环中，PCR产物的量加倍，即PCR产物2倍增加，反应效率为2，扩增效率就为2，就可得2＝10-1/斜率，标准曲线得斜率就为-3.32，斜率得绝对值与荧光曲线间距相同。 如果将扩增效率用百分率来表示，即：E%=(E-1)×100%，对于理想的PCR反应，E=2，即：扩增效率E%=(2-1)×100%=100% 如果E＝1.92，带入方程(1.92-1)×100%=92%，表示每个循环的终点，扩增产物的拷贝数增加1.92倍，或每次循环有92％的模板被扩增。 一般说来，扩增效率接近100％是优化的重复性好实验的最好标志，实际操作时，反应的扩增效率应该在90％－110％之间，如果扩增效率低，可能的原因是引物设计不当，或者反应条件未优化；扩增效率大于100％时，可能的原因是系列稀释样品加样错误，或者有非特异性产物扩增，如引物二聚体产生。用上述方法确定扩增效率时，反应体系中的抑制剂的出现也可能导致扩增效率明显增加，原因是高浓度模板样本中抑制剂的浓度低，导致反应的Ct值延迟出现，而低浓度模板样本中抑制剂浓度高，反应的Ct值延迟程度小，导致斜率的绝对值以及计算所得的扩增效率会增加。如果扩增效率小于90％或大于105％，建议重新设计引物或探针。 相对定量：处理前后基因相比变化了多少 示例 移植前 移植后 移植后患者自身的HLA基因的水平有什么变化？ 相对定量通过内标定量 内标（Endogenous Control）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量 Actin即“肌动蛋白”，是细胞的一种重要骨架蛋白。同时Actin在细胞分泌、吞噬、移动、胞质流动和胞质分离等过程中起重要作用。Actin在不同物种之间高度保守，以至于很难获得较好的针对actin的抗血清。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括α-skeletal muscle actin，α-cardiac muscle actin，α-smooth muscle actin，和γ-smooth muscle actin； 其余两种广泛分布于各种组织中，包括β-acti