生物技术制药大题生技术制药大题.docVIP

现代生物药物分类：①重组DNA技术制造的多肽、蛋白质类治疗剂②基因药物：基因治疗剂、基因疫苗和反义药物等。③天然生物药物：来自动物、植物、微生物和海洋生物的天然产物。④合成与部分合成生物药物。 生物技术药物的特性:分子结构复杂；具有种属特异性；治疗针对性强、疗效高；稳定性差；基因稳定性；免疫原性；体内的半衰期短；受体效应；多效性和网络效应；检验的特殊性 重组蛋白质分离纯化的方法及目的：1、离心/过滤（去除细胞、细胞碎片、颗粒性杂质） 2、阴离子交换层析（去除杂质蛋白、脂质、DNA和病毒等） 3、40nm微孔滤膜过滤（进一步去除病毒） 4、阳离子交换层析（去除牛血清蛋白或转铁蛋白等） 5、超滤（去除沉淀物及病毒） 6、疏水层析（去除残余的杂蛋白） 7、凝胶过滤（与多聚体分离） 8、0.22um微孔滤膜过滤（除菌） 宿主细胞的分类：1原核细胞：常用的有大肠杆菌（分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包涵体，不存在翻译后修饰作用，对蛋白质产物不能糖基化。）、枯草芽孢杆菌（分泌能力强，不形成包涵体，不能使蛋白质糖基化。）、链霉菌（重要的工业微生物。分泌能力强，具有糖基化能力。）等；2真核细胞：酵母（表达产物直接分泌到细胞外，分泌能力强，表达产物能糖基化。）、丝状真菌（很强的蛋白质分泌能力，能正确进行翻译后加工，包括肽剪切和糖基化。）、哺乳动物细胞（表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中，产物是糖基化的，接近或类似于天然产物。）。 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素：（1）外源基因的计量（2）外源基因的表达效率：启动子的强弱、核糖体结合位点的有效性、SD序列和起始密码的间距、密码子组成（3）表达产物的稳定性（4）细胞的代谢负荷（5）工程菌的培养条件 真核基因在大肠杆菌中的表达的形式：以融合蛋白的形式表达药物基因、以非融合蛋白的形式表达药物基因、分泌型表达蛋白药物基因 影响目的基因在酵母中表达的因素：外源基因的剂量、外源基因的表达效率（启动子、分泌信号、终止子）、外源蛋白的糖基化、宿主菌株的影响 基因工程药物生产的过程：获得目的基因、组建重组质粒、构建基因工程菌、产物分离纯化、除菌过滤、半成品检定、成品检定、包装。 提高质粒稳定性的方法：选择合适的宿主菌、选择合适的载体、选择压力、分阶段控制培养、控制培养条件、固定化 基因工程菌的培养方式：1. 分批培养2. 补料分批培养：将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。3. 连续培养：将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定菌体浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。4. 透析培养利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。5. 固定化培养：将固定化技术用于工程菌的培养，质粒稳定性大大提高，特别是对分泌型菌种有利 基因工程菌的不稳定性有哪几种？如何对它进行改善1分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。2结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变 改善1、选择合适的宿主菌2、选择合适的载体3、选择压力4、分阶段控制培养5、控制培养条件6、固定化 基因工程药物的分离纯化：细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品、成品加工。 分离纯化的方法一、根据分子大小不同的纯化方法1. 透析和超滤2.密度梯度离心 3.凝胶过滤二、根据电荷不同的纯化方法1.电泳2.聚丙烯酰胺凝胶电泳3.毛细管电泳4.等电聚焦5.层析聚焦6.离子交换层析 三、利用选择性吸附的纯化方法：疏水作用层析 四、利用配体的特异性亲和力的纯化方法：亲和层析 包含体表达形式的优点：高密度，易于分离纯化，能简化外源基因表达产物的分离操作；有效地抵御了大肠杆菌中蛋白酶对目的蛋白的降解，在一定程度上保持表达产物的结构稳定；对宿主细胞无毒害。 包含体表达形式的缺点：丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象的目标蛋白；体外复性蛋白质成功率低，不超过30%。 动物细胞的生理特点：1、细胞的分裂周期长 2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象 3、正常二倍体细胞的生长寿命是有限的 4、动物细胞对周围环境十分敏感 5、动物细胞对培养基的要求高 6、动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同 动物细胞制药的前景与展望：1、改进表达载体，提高表达水平和产量 2、利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产资本 3、抑制细胞凋亡，延长培养周期 4、采用糖基化工程，提高产品质量 5、转基因动物的研究 6、组织工程的研究 HAT培养基的原理:它是用次黄嘌呤（H）、氨基碟呤（A）和胸腺嘧啶（T）配制的。其中氨基碟呤能阻断DNA合成的主要途