质粒DNA的提取质DNA的提取.docVIP

§2 质粒DNA的提取 一、实验目的 本实验通过质粒快速提取试剂盒的试剂对大肠杆菌中的重组质粒pET22b的抽提，掌握质粒DNA的小量制备方法，了解碱裂解法制备质粒DNA的原理。 二、实验原理 载体是基因工程所必需的工具，它用于将目的基因运载到宿主细胞内的克隆与表达。自然界的质粒经改造以后，常被用作基因工程技术的基因载体。常用的载体有质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、逆转录病毒DNA和昆虫病毒DNA等，而质粒是最常用的载体。细菌质粒是存在于细菌染色体外，能够独立复制的环状DNA。 质粒DNA小量制备是基因工程操作中的常规技术，提取的质粒DNA可用于酶切、连接与转化等。从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA的方法众多，其分离可依据并选择利用DNA分子大小不同，碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构等特点来进行。常用的有碱变性抽提法，羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法，两相法以及溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心法。以上各种方法均有利弊，因此在制备质粒DNA时，要根据以下几个方面进行比较，选择最佳的实验方法：（1）质粒特性：如质粒宿主的菌属，是否需要用溶菌措施。质粒DNA的大小，分子量大的在制备过程中易受损伤，DNA易产生缺口；拷贝数、构型、复制型是否需要氯霉素扩增等。（2）提取质粒DNA的用量与用途：如用于初筛比较分子量大小、进行酶切、作探针或测序等。（3）提取方法的成本、程序、重复性、纯度以及实验室具备的条件等。 目前实验室中最常用、最有效的方法为碱变性抽提法和溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心法两种。碱变性抽提法效果良好，既经济且收得率较高。提取到的质粒DNA可用于酶切、连接与转化。但该法如操作不慎，会影响纯度，且步骤复杂，费时较多。对于分子量较大拷贝较少的质粒DNA，由于DNA片段较大易于损伤断裂，因此选用氯化铯密度梯度超离心法抽提DNA，该法具有纯度高、步骤少、方法稳定且获得的质粒DNA是超螺旋构型等特点。对于高拷贝数质粒，用小量制备法抽提质粒DNA就有足够量可用于后续的操作。 本试剂盒是由上海申能博采试剂公司提供的，其原理是采用碱裂解——中和法。该法抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在pH高达12.6的条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但它的超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的醋酸钠高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，存在于溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀而被除去。再进一步利用酚，氯仿这两种蛋白质变性剂去除蛋白杂质，用无水乙醇沉淀质粒DNA，得到纯化的质粒DNA。 采用碱裂解——中和法，应用常规台式高速离心机，经反应条件最优化后，使含有质粒DNA的上清通过设计独特的离心吸附柱式结构时，被特殊硅基质材料高效、专一地吸附。被吸附的质粒DNA随后可用洗脱缓冲液从离心吸附柱上洗脱下来， 本试剂盒有以下特点：（1）快速方便——半小时完成一次实验，并能在一小时左右，同时处理10-20个质粒样本，操作简便。（2）高效优质——省略苯酚、氯仿的抽提，减少了对质粒DNA的破坏。从2-3ml菌液可提取出约15-20μg质粒DNA，其中超螺旋结构占90%以上，并且也无蛋白质、盐类、有机化合物的污染，可用作测序模板和其它酶促反应。 三、仪器和试剂 （一）仪器：高速离心机、螺旋混合器、冰盒、计时器、1.5mlEppendorf离心管。 （二）试剂：已培养的菌液、质粒快速提取盒（上海申能博彩试剂公司）、无水乙醇。 四、实验步骤 （一）准备工作： 1.试剂公司将质粒快速提取盒送到实验室后，应立即将已加RnaseA的Solution 1置于4℃冰箱保存。 2. Solution 2 及Solution 3如有白色沉淀、高盐结晶析出，请将瓶盖拧松后置于微波炉连续加热10-15秒，或37℃以下保温溶解，摇匀后使用。确保每使用完一种试剂后，立即盖紧该试剂瓶的瓶盖。 3．使用前，必须在22ml Wash Solution 瓶中加入50ml无水乙醇，充分混匀后使用，或按Wash Solution：无水乙醇为11：25的比例，用多少配多少。 （二）实验步骤： 1．收集1.5-3ml菌液于1.5mlEppendorf离心管中，12000rpm离心1min，彻底弃去上清，管底保留沉淀菌体。如果菌体量太少，可再重复收集一次。 2．加入100μl Solution 1，用移液器或振荡器彻底悬浮细菌。 注意：（1）为了获得高质量的质粒DNA，培养细菌的时间不宜过长，一般为12个小时。如果是高拷贝质粒，1.5ml细菌将获得足够的DNA，对于