5-RACE经验.docVIP

5 Race (2007-11-18 21:37:08) 转载▼ 分类： 如果您顺的话，一个礼拜足矣！同意，5-RACE确实比较难，但也有顺利的时候，我上周做5-RACE也一次就成功了，我觉得关键还是RNA 的质量，如果RNA模板质量不好，后面做得再认真也是白费！ 当时要克隆基因的5GC含量达到了80%，一般的反转录酶和PCR都拿不到，后来加了海藻糖60度反转录一个小时后，用TaKaRa的GC-Buffer和LA-Taq才扩出来，当时就为了这个5端，很是费了力气。 如果RCR产物不是很特异或没有目的条带的话，建议用nest PCR。在做5‘时，对RNA要求比较高，最好用新鲜的组织提，随即做逆转录，扩增。做RACE PCR条带单一的不多，尽可能的回收与目的片段大小相近的条带。克隆的时候，一般kit上建议挑8-10个克隆，多一个，多一份希望，因为RACE，尤其是5’太难了，我作了约6个月。 偶没有买试剂盒，自己合成了3条引物，买了反转录酶。然后一次就出来了。 RACE的盒子最常用的是CLONTECH和INVITROGEN的， 这个方法我也试过很多次了，方法很简单，但是作出来效果非常的不理想。PCR出来的东西都是杂七杂八的东西，更多的时候是弥散的条带。SmartRace 既然称之为Smart，因为它的引物能特异的识别5端帽子位点，因此排除了所有非完全的逆转录。再加上使用基因特异性引物，使其做出来的可能性更大。这个方法省钱，但是我不是很看好，祝好运。另，建议你不要用oligodT进行逆转录，在基因mRNA300bp处设计一条或几条基因特异性逆转录引物更好。希望你能有好结果。 我刚做过5’、3‘ RACE，我个人的经验如下：1、首先，提的RNA必须完整，最好跑个RNA电泳来验证一下；2、设计引物时要注意：Tm最好大于70度，两引物间要有100-200bp的重叠区；3、用巢氏PCR相对容易出结果；4、如果出现多个条带，要分别验证；5、PCR过程中，我一般分两次，第一次用touchdowm PCR，后产物稀释50倍，作二次，72度尽量长一点，我们一般用2-3min；6、结果分析，最好是重叠区吻合，否则，应重新做。 这里有两个原因：1、Tm大于70度，好做touchdown PCR；2、相应加长引物，可以更有效地扩增，尤其是针对丰度低、比较难扩的产物。 RACE是采用PCR技术由已知的部分cDNA顺序来扩增出完整的cDNA 3 和5 端的方法，又被称为单边PCR(one-sided PCR)和锚定PCR(anchored PCR)。3-RA CE的—般过程是：以oligo(dT)17和在许多文章中被称为锚引物(anchor primer)或接头(adaptor)的序列组成的引物QT逆转录mRNA得到第一条cDNA链，然后用含部分锚引物序列的引物Q0与基因特异性引物GSP1进行第一轮扩增得到双链cDNA ，第二轮扩增则采用内部引物(nested primer)Ql和GSP2，以防止产生非特异性扩增产物。 采用同样的原理可以进行5-RACE, 先用基因特异性引物GSP-RT逆转录mRNA 获得cDNA第一条链I 然后用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和dATP在cDNA 5 端加上poly(A)尾巴再使用 (1)QT引物合成cDNA第二条链； (2)Qo和一个在GSP-RT上游的引物GSP1扩增cDNA,最后采用内部引物Q1和GSP2进行第二轮PCR扩增以提高特异性。扩增后得到的双链cDNA用限制性内切酶酶切和Southern杂交分析并克隆，得到5特异性和3’特异性的cDNA文库。从两个有相互重叠顺序的5和3 RACE产物中可以获得全长cDNA，或者可以分析5 和3 端顺序，合成相应引物扩增出全长cDNA 。 目前,对于扩增基因的5端还没有一种完美的技术,RACE 也不例外,特别是5RACE 对于得到的克隆(经检测后为阳性克隆),通用的做法是挑选10个以上的单克隆送去测序.就我个人经验,也是挑了5个才测到我的目的基因的. 建议你用clontech 的smart race试剂盒,我以前用的也是TAKARA的,结果做了N 次都没出来,换试剂盒后一次就做出来了.  合成单链CDNA后,用TAQ酶来合成第二条链,也就是相当于双链DNA中的另一条链,用的是上游引物,按照碱基互补的原理,在酶的作用下完成. 我刚刚做过RACE，其实当时本来买试剂盒准备建cDNA文库的，但是库建的不好，杂交了好几次都没杂出东西来，后来用它的接头引物和基因特异性引物扩增，最初只设计了特异性引物的巢式引物，最初扩不出东西来，后来把接头引物也设计了内部引物，而且pcr时把模板的量加大，因为可能模板少也很难扩出来，我们都用