qpcr步骤..docx

范围和适用性 本实验适用于使用StepOnePlus?实时PCR仪对DNA PE、DNA PE Index、SE文库以及Exon Capture组、转录组、表达谱、SmallRNA组、表观遗传组等制备的文库进行上机前的精确定量。摘要荧光定量PCR实验是以Agilent 2100Bioanalyzer对文库的检测结果为参照, 使用StepOnePlus?实时PCR仪对文库进行定量,得出待测文库浓度，为之后的Cluster制备提供浓度依据。该实验的主要内容包括：（1）梯度稀释标准品；（2）按实验要求稀释样品；（3）配制反应预混液；（4）加样；（5）设置反应程序；（6）运行实验；（7）分析实验结果，计算待测样品浓度。整个流程需要3-4小时。缩写词和SOP中专业术语的解释缩写词或术语解释基线(Baseline)扩增曲线中的水平部分阈值(Threshold)高于基线但处于扩增曲线的指数增长区范围之内的荧光水平。C t 值扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。实验材料及方法1 实验试剂和耗材1.1试剂表1-1 实验所需试剂试剂名称货号生产厂家10× BufferDDR006BTAKARAdNTP(2.5mM)DDR006BTAKARAEX HS TaqDDR006BTAKARATaqMan PE Probe上海生工PE Q-PCR Primer 1.1上海生工IndexQ-PCR Primer RR上海生工SEQ-PCR Primer 1.1上海生工SEQ-PCR Primer 2.1上海生工ROX12223－012Invitrogen含ThermoPol缓冲液MgSO4(100mM)B9004SNEBTween20P9416-100MLSIGMADMSODT0163-500ML上海生工BetaineB2629-1KGSIGMASRNA PCR Primer 1上海生工SRNA PCR Primer 2上海生工1.2 耗材表1-2 实验所需耗材耗材型号生产厂家96孔国产光学反应板国产光学封口膜（泛特津）国产0.2ml Sterile, PCR microtubesPCR-02D-CAxygen0.6ml离心管MCT-060-CAxygen吸嘴0.5-10ul超微量、袋装T-300Axygen吸嘴200ul黄色吸嘴、袋装T-200-YAxygen吸嘴1000ul蓝色、袋装T-1000-YAxygen1.5ml离心管MCT-150-CAxygen2 实验仪器设备表2-1 实验所需仪器设备设备型号生产厂家StepOne Plus? Real-Time PCR System4376592ABI迷你离心机LX-200海门其林贝尔VortexQL－901海门其林贝尔微孔板离心机MPS-1000Labnet3 实验操作流程3.1 填写Q-PCR实验登记表样品的交接按照《质控组样品交接管理规程》执行。实验前，先在“表单准备区”将要检测的样品在《Q-PCR实验登记表》中填写好，并根据“文库交接检测”文件夹中《____组文库检测结果》中的待测样品的顺序按顺序填到《Q-PCR实验登记表》上，并在右上角注明批次后打印出来。然后将需要检测的样品的样品名和文库号按照《Q-PCR实验登记表》上的顺序粘贴到“文库核对存放位置”文件夹中的《文库检测前核对表》Excel表中，等待核对样品信息。3.2稀释标准品开始实验前，到-20℃冰箱和冰柜中将实验所需的标准品和样品取出，并按Q-PCR实验登记表上的顺序排好，并到表单准备区，用扫描枪将样品的文库号扫描到“文库核对存放位置”文件夹中的《文库检测前核对表》Excel表中进行核对，核对结果为“错错错错”，则样品不正确需重新找取样品信息相同的样品；核对结果为“对”，则样品正确。核对完样品信息后，将样品和标准品拿到“稀释区”进行稀释。名称移液量超纯水(μl)终浓度(pM)Std 1原管(1 nM)不稀释1000Std 22μl (Std 1)18100Std 32μl (Std 2)1810Std 42μl (Std 3)181Std 52μl (Std 4)180.11）取5个0.2 ml PCR 离心管，分别标记为Std 1、Std 2、Std 3、Std 4和Std 5。标准品多于一种时应标明标准品的名称。2）分别吸取18μl超纯水至Std 2、Std 3、Std 4和Std 5离心管。3）使用新Tip移取2μl Std 1至装有18μl 超纯水的Std 2离心管，用Vortex振荡10至15秒，用力用手甩离心管，将壁上的液体甩下。4）使用新Tip移取2μl Std 2至装有18μl 超纯水的Std 3离心管，用Vortex振荡10至15秒，用力用手甩离心管，将壁上的液体甩下。5）使用新Tip移取2μl S