单克隆抗体技术的应用.doc

第三节 单克隆抗体技术的应用 几十年以来,人们一直尝试利用人免疫系统产生人源性单抗来制备特异性强的人源抗体药物,从而治疗肿瘤、感染性疾病及自身免疫性疾病等。根据用途的不同，单抗大体上可分为三类，即诊断用单抗、治疗用单抗、“生物导弹”用单抗。单抗为人类疾病的防治和诊断、肿瘤体内定位、靶向药物的制备、防止移植物的排异反应、新型疫苗的研制提供了较为理想的手段。 3.1 用于疾病的诊断 1、检测淋巴细胞表面分子，用于鉴别淋巴细胞。 它用于区分细胞亚群和细胞的分化阶段的淋巴细胞。例如检测CD系列标志，有利于了解细胞的分化和T细胞亚群的数量和质量变化，这对多种疾病诊断具有参考意义。细胞表面抗原的检测，将对白血病患者的疾病分期、治疗效果、预后判断等方面有指导作用。组织相容性抗原检测是移植免疫学的重要内容，应用单抗对其进行位点检测可得到更可信的结果。 人体内的淋巴细胞分为T细胞、B细胞和包括NK细胞为代表的第三群细胞，下分若干亚群，各有其特异的表面标志和功能，据此建立许多相应的检测方法。临床上各种类型的免疫缺陷症、自身免疫病以及肿瘤等均可出现不同群淋巴细胞数量和功能的变化。因此计数外周血和组织内淋巴细胞及其亚群的数目或比例，以及它们所显示的功能强弱，可藉此判断机体的细胞免疫水平，对临床认识疾病，探讨其发病机制、观察病情、判断预后、考核疗效以及防治疾病等方面可提供极为有用的信息。 检测人T细胞的特异性抗原，曾采用抗人脑、抗人胸腺细胞和抗人T细胞等抗血清，通过细胞毒试验或免疫荧光染色加以鉴定。自抗白细胞分化抗原的单克隆抗体问世以来，上述诸多方法均被新方法取而代之。常用以鉴定和检测计数T细胞的表面分化抗原如下表所示。 表 T胞表面主要CD抗原及其特异性 用单克隆抗体检测T细胞表面抗原的方法有两大类，一类是用标记抗体着染，如免疫荧光法、酶免疫法、生物素－亲和素（或链霉亲和素）系统的ABC法以及免疫金银染色法；另一类是用抗体致敏的红细胞作花环试验。两类方法各有优缺点。以下叙述有代表性的方法。 （一）间接免疫荧光法 本法是将分离获得的外周血单个核细胞分别与抗相应CD的单克隆抗体（如CD2、CD4、CD8）结合后，洗去游离的抗体，继加荧光素标记的抗小鼠IgG抗血清，经温育结合后，洗去多余的标记抗体，取样制片，用荧光显微镜观察并计数约200个单个核细胞，以荧光阳性细胞与计数细胞总数之比，求得相应CD抗原阳性的T百分率。如有条件，细胞经荧光标记抗体着染后，用流式细胞仪计数，快速而准确，但需要较多的投资，难以普及应用。 （二）免疫细胞化学法 通常用酶免疫检测法，如APAAP酶免疫桥联法。为减少非特异性着染，可选用生物素－链霉亲和素系统试剂作ABC法染色。该类方法可用普通显微镜观察，凡呈棕黄色的细胞为相应CD抗原阳性细胞，计其占总淋巴细胞的百分率。本法简便易行，不需特殊仪器，一般试验室均可采用。　　（三）抗体致敏细胞花环法 用相应的CD单克隆抗体致敏醛化的红细胞作为指示物，它与受检的细胞混匀后，置室温片刻，继经低速离心，移放室温作短期温育或4℃过夜后，重悬取样涂片染色镜检。凡受检细胞周围粘附有3个或更多红细胞的判为花环形成细胞如下图所示，共计数100～200个细胞，以花环形成数与计数细胞总数之比为相应CD抗原阳性细胞的百分率。本法需有相应的致敏红细胞试剂，受影响的因素较前两法多。 图显微镜下的花环,再同骨髓瘤细胞杂交建立相应的杂交瘤细胞株,分泌单克隆抗体,可以同病原体发生特异性的抗原- 抗体反应,通过免疫荧光试验或ELISA 试验对疾病进行诊断。例如转铁蛋白、肾素、甲状腺素(T4)、三碘甲状腺素(T3)、干扰素、补体成分C3、cAMP、cGMP、生长素、绒毛膜促性腺激素(HCG)、促性腺激素(FSH)、胰岛素、IgG、IgE、地高辛、氨茶碱、苯巴比妥、氨基糖甙类抗生素、维生素B12 等单抗均可作为体内激素或药物等微量成分的测定。 如用于诊断乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和各种微生物、寄生虫感染的试剂等。单抗所具有的灵敏度高、特异性好的特点，使其在鉴别菌种的型及亚型、病毒变异株，以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势。 3、肿瘤的诊断和分型。 某些单抗具有在肿瘤部位蓄积的特性，可用于肿瘤的诊断。目前已批准使用的诊断剂有:用于结肠癌的votomab 和arcilumonab,用于探测感染部位的sulemab, 用于卵巢癌的igovomab, 用于黑色素瘤的tecnemab K- 1。例如：刘瑞振等成功地制备了抗人DcR3 McAb，未来对于肺癌、胃肠道肿瘤、脑恶性胶质瘤和胰腺癌的诊断具有很大的帮助。 目前，对肿瘤相关抗原(如甲胎蛋白、肿瘤碱性蛋白和癌胚抗原)的单抗早就用于临床检验。随着淋巴细胞杂交瘤技术的应用，