电泳技术及其在分子生物学中的应用课件.pptVIP

电泳技术及其在分子生物学中的应用 环境科学与技术研究中心 重点内容 影响DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率的因素有哪些？ Western blotting 的基本实验步骤,及每一步的操作意义. 含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围 双链DNA分子在凝胶基质迁移的速率与碱基对数目的常用对数成反比。 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭; 所用的电压 ：低电压时，DNA片段迁移率与所用的电压成正比；电场强度升高时，高分子质量片段的迁移率遂不成比例的增加； 电泳缓冲液 ：组成和离子强度 。 聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE） 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED(N，N，N，N一四甲基乙二胺)和 过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N一亚甲双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶. 与琼脂糖凝胶电泳的比较, PAGE的特点 分辨率很强，长度上相差1bp的DNA即可分开； 从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高，可适用于要求最高的实验（如胚胎注射）； 装载更多的DNA量； 最适合分离小片段DNA(5-500bp),可以分离蛋白质; 聚丙烯酰胺凝胶一律进行垂直电泳. 点多态性实验方法 1.DNA的提取 2.PCR 3.限制性内切酶酶解 4.聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 5.染色 SDS-聚丙烯酰胺凝胶 电泳（SDS）的原理 特点 大多在不连续缓冲体系中进行，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液； 不连续缓冲体系具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，故提高了SDS的分辨力； 系统中所有组分都含有0.1%的SDS。 负极 One-Dimensional SDSIsoelectric Focusing (IEF) Two-Dimensional SDSWestern blotting 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 Western Blotting 基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间。 转膜后检测 丽春红S染色 预染蛋白marker 考马斯亮蓝染色 封闭: 膜上的空白位点 脱脂奶粉（5％） BSA(牛血清白蛋白) 把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育，4 ℃过夜。 倒掉一抗溶液，用PBST(或TBST)漂洗液滤膜3次，每次10min。 加入二抗溶液，摇床上缓慢摇动， 37℃ 2 小时。 倒掉二抗溶液，用PBST (或TBST)漂洗液滤膜3次，每次10min。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 积层胶 分离胶 加样孔 正极 配置 积层胶 分离胶 丙烯酰胺浓度 5% 10-15% Tris-HCl 1M，PH=6.8 1.5M，PH=8.8 SDS，过硫酸铵，TEMED浓度相同 电泳 积层胶 分离胶 电压 80V 120V Tris-HCl -甘氨酸电泳缓冲液(pH8.3)在凝胶中的电离情况 甘氨酸→带负电的蛋白质亚基→Cl- 带负电的蛋白质亚基→甘氨酸-→Cl- 被分离蛋白质亚基的电离情况 蛋白质亚基由于甘氨酸的挤压作用，在积层胶不被分离，而是被浓缩为最小体积 蛋白质亚基在分离胶根据分子量的大小被分离 考马斯亮蓝染色(0.1-1.0ug的多肽) 等电聚焦电泳的过程 电泳时可将样品置于凝胶的任何位置； 初始位置在负极时，因pH＞pI，蛋白质分子带负电，电泳时向正极移动；移动过程中，pH逐渐下降，所带负电荷量逐渐减少，蛋白质移动速度减慢；当移动到pH=pI时，蛋白质所带净电荷为零， 蛋白质即停止移动； 各种不同蛋白质在电泳结束后，会分别聚集于相应的等电点位置，形成一个很窄的区带；区带的位置是由pH梯度的分布和蛋白质的pI所决定，而与蛋白质分子的大小和形状无关。 PI (by isoelectric focusing – IEF) Approximate mol wt. (by SDS PAGE) Example of 2