扫描电镜及其制样技术-1.pptVIP

扫 描 电 镜 技 术Techniques of Scanning Electron Microscope 一、扫描电镜的基本结构与成像原理 二、扫描电镜的特点 三、扫描电镜的生物样品制备技术 （一）样品的常规制备方法 （二）特殊样品的制备方法 扫 描 电 镜 技 术 扫描电镜（Scanning Electron Microscope，SEM） 是继光镜和透射电镜之后发展起来的一种电镜，用于观察物质表面及断面的三维形貌结构和进行微区成分分析。 1、 SEM基本结构及其作用 （１）电子光学系统　 电子枪：阴极、阳极、栅极。 阴极—通电加热后产生电子束。 阳极—加速电子束。 栅极—控制和会聚电子束流 。 电磁透镜：会聚电子束，形 成直径5~10纳米的电子束（即电子探针），照射于样品上 。 （２）检测系统 ①二次电子的来源及作用 在样品表面以下几纳米到几十纳米的区域，被入射电子（初级电子、一次电子）所激发出来的样品原子中的外层电子，称谓二次电子（次级电子）。 SEM通常是由二次电子所形成的图象来显示生物样品的表面形貌。 （２）检测系统 ② 二次电子检测系统的组成及作用 组成：检测器（二次电子探头）、光电倍增管、视频放大器。 作用：对二次电子进行收集、放大和处理，以调制显像管栅极电压并成象。 （３）电子偏转系统（扫描系统） 组成：扫描发生器、扫描线圈。 作用：使镜筒和显像管内的电子束分别进行同步光栅状扫描，最后在显像管的荧光屏上显示出完整图象。 2、影响图象形成的因素 （1）倾斜角效应 —— 二次电子成像原理 ∵ 二次电子产率主要取决于电子束的入射角，而入射角又主要取决于样品的倾斜程度。 ∴ 样品的倾斜角效应是影响图象反差的主要因素。 ∴ SEM图象的反差主要是由样品表面的凹凸状态决定的，越是凸出的部位产生二次电子的数量越多，图象越明亮，反之则较暗。 2、影响图象形成的因素 （2）原子序数效应 原子序数效应：样品内原子序数不同的元素，在图象上也会形成一定的亮度差异，这种现象称为原子序数效应。 对策：观察生物样品时，在样品表面喷镀一层原子序数高的金属膜，可提高图象质量。 2、影响图象形成的因素 （3）充放电效应 充电：当初级电子轰击干燥的生物样品表面时，会因其导电性能差而发生电荷积累的充电现象，并对随后到来的初级电子产生排斥，使电子散开，且导致二次电子发射轨迹偏斜或杂乱。 放电：轰击区内电子堆积，与邻近区域间产生电位差，则可产生放电打火现象。 充放电效应：上述充、放电状况造成图象忽明忽暗或模糊不清等现象，称为充放电效应。 对策：采用金属镀膜、导电胶粘贴样品等导电处理，可减少充放电效应的影响。 二、扫描电镜的特点 （一） 图 谱 （二）扫描电镜的特点 观察表面形貌。 图象景深大，富有立体感。 放大范围广，分辨率较高：放大倍数为数10倍~数10万倍；分辨率取决于电子探针的直径，一般为5~10 nm。 可观察块状样品： 0.5~10cm3。 样品制备简单。 可结合元素分析。 三、扫描电镜生物样品制备技术 （一）样品的常规制备方法 取材 → 清洗 → 固定 → 清洗 →脱水 →干燥 → 金属镀膜 → SEM观察 1、取样 取样部位要准确。 取样大小要适当：常为≤1cm3。 取样操作要轻巧快捷：取样要快，严防对样品的挤压损伤，以使样品更近于活体状态。 样品的基底部应切割平整（以便于样品粘贴），观察面应作好识别标记。 2、清洗 （1）清洗的目的： 充分暴露样品观察面的表面特征。 （2）清洗液的选择 常规洗液——生理盐水、PBS等缓冲液； 特殊洗液——低浓度的蛋白水解酶或乙醇等，用于表面覆 盖着大量蛋白或脂类黏液的样品（如胃、肠黏膜及乳腺组织等）的初级清洗。 （3）清洗的方法 浸泡清洗。 震荡清洗：一些粘着杂质多而紧密的样品（如胃、肠黏膜 等），可利用震荡器进行震荡清洗。 离心清洗：游离细胞、微生物及其它微小生物样品的清洗。 （4）清洗的要求 样品要清洗干净：换液数次，可在解剖镜下检查，直至干净，以充分暴露表面特征。 4、脱水 （1）脱水的目的 用低表面张力且易挥发的有机溶剂（乙醇、丙酮等）取代组织细胞中的游离水，使样品在后续干燥处理时的表面张力减少。 表1 几种液体的表面张力 单位：达因/cm （2）脱水的方法 PBS清洗3次，5~10min/ 次→ 乙醇梯度脱水到纯乙醇，5~30min/级。 （3）脱水的要求 脱水要彻底； 严防发生空气干燥：在换液过程中，要始终保持样品润湿，以免因表面张力变化而