体细胞的反转座子改变了人类大脑的遗传景观..docVIP

体细胞的反转座子改变了人类大脑的遗传景观 摘要 反转座子是可移动的遗传元素，使用“复制-粘贴”的机制遍布到后生动物的基因组中，至少50%的人类基因来自反转座子，有三个活跃家族（l1，AluandSVA)与插入的突变和疾病基因有关。体细胞中表观遗传和转录后会抑制反转座子区，除了胚胎早期发育细胞和一些恶性肿瘤细胞。近期的报告呈人类大脑中l1的表达和拷贝数变异表明l1动员也可能出现在后期的发展中。然而，相应的综合位点并没被反映出来（基因的确定位置）。此时我们运用一种高通量的方法去识别大量的l1，AluandSVA的种系突变，即就是将我们假定的l1体细胞7743分别插入到三个人的海马体和尾状核中，出人意料的是我们分别在13692和1350体细胞中发现插入了Alu和SVA。我们的结果表明在人脑中反转录转座子动员蛋白质编码基因产生了不同的表达活性。如此一来由反转录转座子驱动的体细胞基因组镶嵌性可能重塑基因的电路来支撑正常的或不正常的神经生物学过程。 恶性肿瘤与衰老通常与毒性突变的积累有关从而导致功能丧失，细胞死亡或者失控生长。反转录转座子是明显的诱变剂，据估计4亿种反转录转座子派生的结构变异存在于全球人口中和超过70种涉及了遗传和新合成反转录转座子事件的疾病中。可能因转座子能力的原因反转录转座子大量甲基化和大量转录灭活。然而在神经细胞系中已经检测到大量的体细胞L1反转录转座子。考虑到哺乳类动物大脑组织复杂的结构和功能以及它的自适应和再生能力还有神经生物学失常未找到的的病因，想必这些体细胞L1的插入可能有重大意义。 观察到大脑中的置换活动有一种解释大概是L1启动子会短暂释放从神经发生的表观遗传抑制期间。L1转换能力可以反复地动员不同的个人位点细胞来产生体细胞镶嵌性。多方面证据支持这个模型，比如在不同年龄捐助者的大脑组织中的L1转录和拷贝数变异（CNV）以及动员在转基因老鼠体外设计的L1。重点是现在也不知道体细胞L1插入后将在基因组中的哪里出现，考虑到开放的核染色质容易L1集成，这些事件中的无论哪一件都不同程度的影响大脑中蛋白编码基因座的表达。 在不同的细胞群中映射出个人逆转录转座子事件共同形成一个体细胞镶嵌现象，最有挑战的是每个突变的稀有等位基因。我们因此开发一种高通量的协议被称为逆转录转座子测序。首先片段的基因组DNA是杂化自定义序列捕获完整的L1，Alu和SVA逆转录转座子的目标数组5′—3′末端（如图1a）。稳定的ERVK和ERVILTR基础作为负性的控制。其次，捕获测序的DNA，每101单体单元序列样本可生成25亿个双末端 (如图1b)。最后设计保守的计算途径去识别被映射的测序对(如图1cd)。 如下图所示： Figure 1: 整体RC-seq方法 反转录转座子捕获：剪切基因组DNA杂化特定的嵌合芯片探测反转位子活动（浅蓝色背景可高亮显示核苷酸） 测序：杂交后，用Illumina公司定序器筛选和分析DNA片段，在每一个基因序列中双末端测序2.5*107bp，随后配对到参照基因组中。 测定的序列映射出一对单一的基因座显示出已知的逆转录转座子插入。 测定的未配对序列的末端映射出单一的基因座和其他的末端映射出远端的逆转录转座子，显示出新颖的逆转录转座子事件。 先前的工作相当于在体外体细胞动员L1拷贝数变异。为了L1的拷贝数变异我们用RC-seq来检验这个假想，首先从三个捐献者中（A,BC）各选取5个大脑分区。一个显著增加的是我们在捐献者C的海马体DNA提取物中观察到大量的L1 ORF2基因的复制, 类似于捐献者A，尽管A是小规模增加（如图2）。使用三个捐献者的样本将RC-seq运用到他们大脑的5个分区中，其展示出最高和最低的L1拷贝数变异，包括捐献者A尾状核的技术复制。在七个基因库中，总共有1.774亿个序列双末端用高通量转录组分析（RC-seq）而生成。RC-seq实现了深度分析其覆盖了已知活跃的逆转录转座子，高度的重复性和有限序列的捕获偏差。 图2.在人脑中用多样的定量多聚酶链式反应来证实L1拷贝数变异。 L1开放阅读框2的相对丰度对a卫星重复序列使用基于现有的 TaqMan方法而被定量化。分析化验来自三个捐献者的大脑的五个 区域的基因组 DNA（A,BC）。海马体（Hi）；硬膜（Pu）；颞中 回（TG）；尾状核（Ca）;额中回（FG）。价值是使每个捐献者的 尾状核正常化。这种误差线相当于一个标准差。对每一个捐献者 用重复测量的方法进行方差分析其p0.001，随后成对比较调整最 小显著差。 逆转录转座子插入的序列对的诊断结论是以插入位点，相对走向和逆转录转座子家族为基础而聚