候选蛋白的验证技术..docxVIP

候选蛋白的验证技术免疫印迹法（blotting）:是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。免疫组化法免疫荧光法流式细胞术免疫印迹法Western BlottingWB=SDS电泳+将分离的多肽从凝胶转移至固相支持体+抗原抗体反应步骤：制胶→蛋白样品制备和上样→电泳→转膜→封闭→一抗杂交→二抗杂交→底物显色SDS电泳原理加入SDS破坏蛋白质的氢键、疏水键，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物，大量SDS结合后，让各种蛋白都带上相同的负电荷（远大于原有电荷量，原有电荷量忽略）和破坏部分的蛋白质空间结构；加入β-巯基乙醇破坏二硫键，破坏蛋白质的空间结构。最终蛋白质的迁移率主要取决于它的分子质量。在电场作用下，带有负电荷的蛋白质，向胶板下方移动（+极），分子量小的蛋白质所受阻力小电泳快，位于胶板最下方，分子量大的相反，各蛋白质依分子量被分散于电泳道各处。在不连续电泳时，采用了两种缓冲液，其凝胶孔径、pH值、电泳电压和PAGE浓度不同。上层胶为浓缩胶（大孔径，PH6.8，PAGE 5%），下层胶为分离胶（分子筛，PH8.8，电压120V，PAGE根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度）。浓缩胶中的缓冲对为Tris-HCl，电泳Buffer的缓冲对为Tris-甘氨酸。胶中的Cl-移动最快，电泳Buffer中的甘氨酸（pI为6.0）在浓缩胶pH6.8时解离度很小，故移动最慢。而SDS-Protein 在无分子筛效应的大孔径浓缩胶中移动速度居第二。即泳动速度为Cl- 蛋白甘氨酸离子。加上电压后，氯离子和甘氨酸离子分离开来，在二者之间形成一个导电性较低的区带（因为之间电荷少），由于导电性和电场强度成反比，这一区带的电压梯度较高，又反过来加速位于区带后方的甘氨酸离子的泳动，使其追赶氯离子，建立甘氨酸和氯离子的电压梯度和泳动速度乘积相等的稳定态，使这些带电颗粒以相同的速度泳动（这两种离子之间有明显的边界，电泳调节一定的情况下，此高电压梯度带宽度不变）。蛋白质则以相同的速度和相对固定的位置在此高电压梯度带中泳动，同时受此高电压梯度影响，蛋白质分子被堆积在一起，形成一条狭窄的条带。当此高电压梯度带移动到浓缩胶和分离胶界面时，凝胶PH增高，大量甘氨酸解离并带上负电荷，此时甘氨酸的泳动速率明显增加，超越蛋白质分子，位于氯离子后，使高电压梯度带缩窄，蛋白质则不再位于该带内，落在后面的蛋白质便在均一的电压梯度和PH环境中泳动，并根据其固有分子量大小进行分离。制胶（先下后上）配制SDS的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶，按需配体积)：成分配制不同体积SDS浓缩胶所需各成分的体积（毫升）5%胶2346810蒸馏水1.42.12.74.15.56.830%Acr-Bis(29:1)0.330.50.671.01.31.71M Tris-HCl,pH6.80.250.380.50.751.01.2510%SDS0.020.030.040.060.080.110%过硫酸铵（AP）0.020.030.040.060.080.1TEMED（1‰V）0.0020.0030.0040.0060.0080.01依据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度(实质就是丙烯酰胺的浓度)，再按照下面的表格配制SDS的分离胶(即下层胶)：SDS分离胶浓度最佳分离范围6%胶50-150kD8%胶30-90kD10%胶20-80kD12%胶12-60kD15%胶10-40kD成分配制不同体积SDS分离胶所需各成分的体积（毫升）6%胶51015203050蒸馏水2.04.06.08.012.020.030%Acr-Bis(29:1)1.02.03.04.06.010.01M Tris-HCl,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵（AP）0.050.10.150.20.30.5TEMED（1‰V）0.0040.0080.0120.0160.0240.04成分配制不同体积SDS分离胶所需各成分的体积（毫升）8%胶51015203050蒸馏水1.73.35.06.710.016.730%Acr-Bis(29:1)1.32.74.05.38.013.31M Tris-HCl,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%过硫酸铵（AP）0.050.10.150.20.30.5TEMED（1‰V）0.0030.0060.0090.0120.0180.03成分配制不同体积SDS分离胶所需各成分的体积（毫升）10%胶51015203050蒸馏水1.32.74.05.38.013.330%Acr-Bis(29:1)1.73.3