PFGE-科室培训资料O157版解析.doc

大肠杆菌O157（志贺氏菌宋内血清型）PFGE标准方法 第一天 胶块的制备 在Falcon 2054管上标记样品名称和空白对照，分别加入约2ml（1ml）细胞悬浊液（CSB）； 在1.5ml eppendorf管上标记好对应样品的名称； 在模具上标记好对应样品的名称； 用CSB湿润接种环，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于CSB中， 用bioMerieux Vitek colorimeter测其OD值，并调整至3.6~4.5（4.0）。如果OD值大于4.5，加入CSB稀释；如果OD值小于3.6，增加菌量提高其浓度。 取400μl细菌悬浊液于相应的1.5ml eppendorf管中，置于37℃水浴中孵 育5分钟。将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备好放在水浴摇床中。 从水浴箱中取出eppendorf管，每管加入20μl蛋白酶K（储存液浓度为 20mg/ml）混匀，使其终浓度为0.5mg/ml。 制备好1%Seakem Gold：1%SDS，放于56℃水浴箱中。 在eppendorf管中加入400μl的1% Seakem Gold：1%SDS，用枪头轻轻 混匀。 将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固10-15分钟。 注意事项： 用后的接种环要放在指定的废弃物容器中。 细胞悬浊液、蛋白酶K要置于冰上。 在混合细胞悬浊液和1% Seakem Gold：1%SDS时要避免气泡的产生。 混合物加入模具时不能产生气泡。 在加1% Seakem Gold：1%SDS的过程中1% Seakem Gold：1%SDS要一直放在56℃水浴箱中。 细胞的裂解 在50ml的screw-cap tube上做好标记。 配制细胞裂解液（CLB）：每5ml细胞裂解液加入25μl蛋白酶 K（20mg/ml），使其终浓度为0.1mg/ml，然后颠倒混匀。 注意：蛋白酶K要置于冰上，配制好的细胞CLB也要置于冰上。 每个管子加入5ml蛋白酶K/CLB混合液。 如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面多余的部分。 可重复利用的模具：打开模具，用小铲的宽头部分将胶块移入相应的screw-cap管中。 一次性模具：撕掉模具下面的胶带，用小铲将胶块捅进相应的screw-cap管中，将模具、胶带、小铲放入废弃物容器中。 保证胶块在液面下而不在管壁上。 将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速约130转/分钟。 将纯水和TE放在50℃水浴箱中预热。 三、洗胶块 从水浴摇床中拿出screw-cap管，盖上绿色的screened-cap。轻轻倒掉 CLB。在实验台上轻磕管底使胶块落在管底。 注意： 把管倒置在吸水纸上，使管内液体被尽量排除干净。随后的操作中也如此。 每管中加入15ml预热的纯水。 确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回50℃水浴摇床中，摇10分钟。 倒掉水，用纯水再洗一次。、 倒掉水，加入15ml预热的TE，在50℃的水浴摇床中摇15分钟。 倒掉TE，用TE重复洗三次，每次10－15分钟。 倒掉TE，加入10ml TE，放在4℃冰箱保存备用。 注意：要确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上。 四、胶块内DNA的酶切 在1.5ml eppendorf管上标记好相应的样品及H9812的名称。 按照下面的比例配制缓冲液M的稀释液，混匀。 试剂 μl/胶块 μl /10胶块 纯水 120μl 1200μl Buffer M 15μl 150μl BSA 15μl 150μl 总体积 150μl 1500μl 注意：缓冲液要置于冰上。 在每个1.5ml eppendorf管中加入200μl缓冲液H的稀释液。 小心从TE中取出胶块放在干净的培养皿上。 用刀片切下2mm宽的胶块放入1.5ml eppendorf管中。确保胶块在液面下面。将剩余的胶块放回原来的TE中。 用同样的方法处理标准株H9812的胶块。 将管子放在37℃水浴中孵育10-15分钟。 在用稀释缓冲液孵育的过程中，按照以下的比例配制酶切缓冲液，混匀。 试剂 μl/胶块 μl /10胶块 纯水 157μl 1570μl Buffer M 20μl 200μl BSA 20μl 200μl 酶（15U/μl） 3μl 30μl 总体积 200μl 2000μl 注意： 将酶置于冰上，用后立即放在－20℃保存。 用枪头吸出缓冲液M，避免损伤胶块。 每管加入200μl混合液，轻轻在实验台上磕管子的底部，确保胶块在液面的下面。 在37℃水浴中孵育至少2小时。 五、加样 （一）将胶块直接粘在梳子齿上 调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。用水平仪调整胶槽使 其水平。 从37℃水浴中取出胶块，平衡到室温。 用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。 每管加入200μl 0.5×TB