实验4、质粒DNA的转化.ppt

实验四、质粒DNA的转化 一、实验目的 学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。 二、实验原理 转化（transformation）:把外源DNA分子导入到某一宿主细菌细胞的过程称为转化。当细菌处于容易吸收外源DNA的状态即感受态时，转化最易发生。 当受体菌处于感受态时，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羧基钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收外源DNA。在培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。被转化的细菌中，载体中抗抗生素基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子（transformant）。 三、材料仪器 实验仪器 超净工作台、恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、涂布棒，微量取样器，冰盒等。 实验材料 大肠杆菌DH5α感受态细胞； 质粒DNA:pCR4ToPoGt5GT7(Kan+Amp抗性)； LB固体培养基； 含Kan+Amp的LB固体培养基：将配好的LB 固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Amp和Kan储存液，使终浓度分别为50μg/ml，摇匀后铺板。 四、实验步骤 4.向上述eppendorf管中加入200uL LB液体培养基（不含抗生素），混匀后37℃振荡培养20min，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗性基因； 5.将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Kan+Amp的筛选平板上，涂布之后，在37℃培养箱中正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养12-16小时； 6. 涂布细则如下表：  一 实验目的 二 实验原理 三 材料仪器 四 实验步骤 五 实验结果图 六 结果讨论 七 思考题 1．从冰箱中取出感受态细胞，放置冰上； 2．每组分别取2管20μl感受态细胞悬液； 第一管为转化实验组：1μl重组质粒DNA+20μl感受态细胞； 第二管为阴性对照组；加入1μl无菌水+20μl感受态细胞悬液；轻轻摇匀，冰上放置30分钟； 3．将管放入42 ℃恒温水浴中90秒，迅速将eppendorf管移到冰浴上，冷却2 min； + 420C热击 370C复苏 Kan+Amp筛选 感受态 细胞 质粒 DNA 100 Amp+Kan — 1 1-5-转化-Amp+Kan 100 Amp+Kan 1 — 1-5-对照-Amp+Kan 100 无 1 — 1-5-对照-无 5 100 Amp+Kan — 1 1-4-转化-Amp+Kan 100 Amp+Kan 1 — 1-4-对照-Amp+Kan 100 无 1 — 1-4-对照-无 4 100 Amp+Kan — 1 1-3-转化-Amp+Kan 100 Amp+Kan 1 — 1-3-对照-Amp+Kan 100 无 1 — 1-3-对照-无 3 100 Amp+Kan — 1 1-2-转化-Amp+Kan 100 Amp+Kan 1 — 1-2-对照-Amp+Kan 100 无 1 — 1-2-对照-无 2 100 Amp+Kan — 1 1-1-转化-Amp+Kan 100 Amp+Kan 1 — 1-1-对照-Amp+Kan 100 无 1 — 1-1-对照-无 1 受体菌/μl 平板抗性 灭菌水/μl DNA/μl 培养皿编号 组别 100 Amp+Kan — 1 1-9-转化-Amp+Kan 100 Amp+Kan 1 — 1-9-对照-Amp+Kan 100 无 1 — 1-9-对照-无 9 100 Amp+Kan — 1 1-8-转化-Amp+Kan 100 Amp+Kan 1 — 1-8-对照-Amp+Kan 100 无 1 — 1-8-对照-无 8 100 Amp+Kan — 1 1-7-转化-Amp+Kan 100 Amp+Kan 1 — 1-7-对照-Amp+Kan 100 无 1 — 1-7-对照-无 7 100 Amp+Kan — 1 1-6-转化-Amp+Kan 100 Amp+Kan 1 — 1-6-对照-Amp+Kan 100 无 1 — 1-6-对照-无 6 受体菌/μl 平板抗性 灭菌水/μl DNA/μl 培养皿编号 组别 涂布棒的使用 1、使用前，浸入75%酒精中； 2、在酒精灯上引燃涂布棒上的酒精（不要烧到手）； 3、等酒精烧完后，让涂布棒在空气中冷却； 4、涂布均匀； 5、将涂布棒重新除菌以备下一次使用； 6、阴性对照与重组DNA的涂布棒区别使用，避免DNA污染。 A(对照-Amp+Kan):100ul菌液涂布于LB+Amp+Kan培养基，菌落生长情况; B(转化-Amp+Ka