PCR, primer, expression design课件.pptVIP

PCR技术原理 循环过程(32 次左右） 1.解链：94 ℃, 30 s 2.引物结合: ？ ℃ ，30 s 3. 延伸：72 ℃，？Min 特点 1. 引物两条，以2n指数扩增（前20-25次），后面扩增效率降低，30次以后，基本进入平台期。 2. 引物结合温度？ ℃一般为50-55 ℃， 需要调整； 3. 延伸时间？Min需要调整，一般1kb / min. PCR技术应用 1. 基因检测； 2. 基因的制备（包括基因的修饰） PCR技术操作要点 1. 灵敏度高，防止污染，出现假阳性(带手套，设立阴性，阳性对照）； 2.特异性---- A. 引物的设计; B. 退火温度; 3. PCR扩增程序的设计; 4.平台期, 5. dimer的形成. 引物的设计 常规设计原则 特殊用途设计技巧 引物常规设计原则 1. 长度：１５～３7 nt, 一般２０nt左右; (仅binding , 不含接头) 2. G + C 含量４０％～６０％ 3. 避免聚嘌呤或聚嘧啶或有回文对称结构； 4. 引物自身不能互补（3个） 5. 引物之间不能互补（5?个） 6. 引物３端不能错配, 不能修饰，尽量不用A, 不能超过３个连续的G或C； 7. ５端可变化修饰，附加酶切位点； 8. 两引物的Tm值应比较接近； 9. 正链引物：mRNA序列照抄； 负链引物：先写出mRNA序列的互补序列，然后翻转重写。 １０．解链温度Tm = 4 (G+C) +2 (A+T) [ =20 nt ] 　　　　　　　Tm = 81.5 +0.41*(GC%)-600/L [ 20nt] Tm一般５５℃～８０℃　　　［５５℃～５８℃最佳］ PCR反应中结合温度（anneaning temperature）T = Tm - 5℃ 特殊用途引物设计技巧 1. 5’附加酶切位点(定向克隆): 2. 引入点突变 3. 有不确定序列 4. PCR产物直接测序 5’附加酶切位点(定向克隆) 1、不同酶的保护碱基序列不同；NEB catalog提供相关资料。 2、有些酶的保护碱基包含其它酶切位点，注意双酶切的先后顺序: Nde1 ? Eco R1 引入点突变 1. 一条引物最多引入3个点突变,可延长引物长度. 2. 突变位点要靠近5’端. 3.要注意密码子的偏好性, 简并性 有不确定序列－－（3～4种） 5’ ATG GGC ICC AIA ICT TCT ACC 3’ 说明：1、次黄嘌呤核苷酸I可与四种碱基配对； 2、可用于PCR产物直接测序。 有不确定序列－－（2种） 5’ ATG GGC A CC ATA GCT TCT A(A/C)C 3’ 说明： 1,表示该位点有两种可能的序列A或C; 2. 合成引物时只要一条引物的money; 实际得到的是两条引物等比例的混合物： 5’ ATG GGC A CC ATA GCT TCT AAC 3’ 5’ ATG GGC A CC ATA GCT TCT ACC 3’ 3、设计时可靠近 3‘ 端 4、不能用于PCR产物直接测序 表达载体的类型 融合型表达载体：----融合蛋白 非融合型表达载体：---天然完整蛋白 分泌型表达载体：----产物可跨膜分泌至胞周间隙 Intein: DTT诱导自剪切 CBD：chitin binding domain（几丁质结合位点） MCS: 多克隆位点 Amp： Amp抗性基因 常用的融合表达载体 PGEX系列：N端融合GST蛋白，用GST柱亲和纯化； 谷胱甘肽洗脱，用Xa因子酶切除去亲和Taq。 PTXB （pTYB) 系列：N端(或C端）融合CBD蛋白，用chitin柱亲和纯化； DTT诱导柱上切割纯化。 pET系列：融合6 his Taq, 用镍柱亲和纯化，用Xa因子酶切除去亲和Taq。。 M C I GST-P9 Factor-Xa P9 97 66 43 31 14 20 kDa 位相载体----含有3种读码框的系列载体 融合蛋白的功能 1、提高外源基因的表达量 2、帮助外源基因正确折叠（可溶） 3、提供亲和标记，方便纯化； 4、提供亲和标记的还可作为检测靶点，方便检测。 蛋白表达中常见问题 一、真核基因在原核中表达： 1、要用原核基因的表达载体（P,O,SD） 2、要去除内含子（mRNA制备） 3、密码子的偏好性 4、要注意插入读框正确。