细菌的分离培样及鉴定细菌的分离培样及鉴定.ppt

细菌的分离培养 细菌的染色镜检 细菌的生化试验 一、细菌分离培养 1、需氧菌的分离鉴定 细菌分离培养一般采取“划线法”，主要有分区划线，十字交叉划线等方法，具体方法可按照个人习惯选择应用，目的是达到使被检材料适当的稀释，以达到获得独立单在的菌落，防止形成菌苔，以致不宜鉴别其菌落性状。 操作方法： 1、左手持平皿，用左手的拇指、食指和中指将平皿盖揭开呈20°左右的角度； 2、右手持接种环，从混合培养物中沾取少许混合物涂布在培养基边缘，然后将接种环多余的混合物在火焰中烧灼，待冷却后，再与所涂混合物的地方轻触，在空白区划线，后再烧灼，冷却后再在空白区划线，反复操作，直至混合物稀释到足够形成单菌落。 注意事项： A 划线前先将接种环稍弯曲，使其和平皿内琼脂面平行，不致于划破培养基。 B 划线中尽量不要重复、往复划线，以免形成菌苔。 C 划线接种完毕，在平皿底部写上菌名、日期和接种者等标记，然后倒扣培养。 2、厌氧分离培养 1、接种方法与需氧菌分离接种方法相同，仅培养条件发生变化。 2、厌氧培养方法主要有：二氧化碳厌氧法、生物学方法、化学方法、物理学方法等。 二氧化碳厌氧法： * 简单的二氧化碳培养法可在盛放有培养物的有盖玻璃缸内，燃点蜡烛，盖上玻璃缸盖，当火焰熄灭时，该缸内空气二氧化碳浓度大约增加了5%～10%。 * 化学方法生成二氧化碳，碳酸氢钠与硫酸钠或碳酸氢钠与硫酸作用即可生成二氧化碳。 * 现在实验室设备中，已有二氧化碳培养箱，只需把二氧化碳的浓度设置成所需浓度即可达到相应的厌氧环境。 生物学方法： * 原理：利用培养基中含有的植物或动物组织消耗氧气的原理制成。植物或动物的组织具有呼吸作用，组织中的可氧化物质也可以消耗培养基中的氧气。 * 植物组织包括马铃薯、燕麦、发芽谷物等； * 动物组织包括新鲜无菌的小片组织或加热杀菌的肌肉、心、脑等。 * 目前比较常用的有厌气肉肝汤培养基、碎肉培养基等。 化学方法： * 原理：利用还原性比较强的物质将培养环境或培养基内的氧气吸收。 * 连二亚硫酸钠、碳酸钠和氧气反应生成硫酸钠、亚硫酸钠和二氧化碳，消耗环境中的氧气； * 每100立方厘米空间用1g焦性没食子酸及10ml 10%氢氧化钠或氢氧化钾，焦性没食子酸在碱性溶液中吸收大量氧气，生成焦性没食橙。 物理学方法： * 原理：利用加热、密封、抽气等物理学方法，以驱除或隔绝环境及培养基中的氧气，使其形成厌氧环境，利于厌氧菌的生长。 * 常用的方法有厌氧罐法、真空干燥器法、高层琼脂法、加热密封法等。 3、纯培养与移植 *培养皿接种到斜面、单菌落接种到增菌肉汤、穿刺培养。 培养皿接种到斜面：右手执无菌接种棒，无菌条件下，左手打开平皿盖，用接种环挑取单菌落，立即取琼脂斜面小管，将管口火焰灭菌。右手小指夹住管塞拔出，将接种针深入到待接小管中，从斜面底部开始划曲线，从下至上直至斜面顶端为止。管口通过火焰灭菌后，盖好管塞。最后标注菌名、时间和接种者，置适宜条件培养。 *单菌落移植到肉汤培养基中增菌：挑取单菌落过程如上所述，接种到肉汤小管内，置于适宜条件培养。 *穿刺培养：半固体移植采用穿刺法接种，方法基本与纯培养接种相同，差别在用接种针挑取单菌落，垂直刺入培养基内。 注意事项： A 接种环（针）火焰烧灼灭菌后要稍冷却后再挑取菌落； B 打开平皿，接种过程保持无菌状态，尽量靠近酒精灯燃心； C 接种后，培养小管或平板要置于适宜条件，利于细菌生长； D 穿刺培养，接种针要直刺直出，不要反复戳刺； E 芽孢菌耐杀灭，培养芽孢菌的实验室最好单独使用，否则要彻底灭菌。 二、细菌抹片的制备及染色 1、细菌染色原理 由于细菌细胞结构和化学成分不同，因此具有毛细管、渗透、吸附和吸收等物理作用及离子交换、酸碱亲和等化学作用。 利用各种染料对细菌细胞产生的各种物理、化学作用，使其着色情况具有差异，便于镜检观察。 2、细菌抹片的制备 A 玻片准备：用95%酒精浸泡或滴95%酒精2～3滴，用洁净纱布擦拭，然后在酒精灯外焰上拖过几次，若油渍比较顽固，可滴1～2滴冰醋酸，用纱布擦拭后，在酒精灯外焰上拖过几次。处理过的载玻片应清晰透明，洁净而无油渍，滴上水后能均匀展开，附着性好。 B 抹片： 液体材料：如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等，可直接用灭菌接种环沾取一环材料，在载玻片中央均匀涂布成适当大小的薄层。 非液体材料：如菌落、脓、粪便等，现用接种环取少量生理盐水置于载玻片中央，然后在用灭菌接种环沾取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。 组织脏器材料：可先用镊子夹持中部，然后用灭菌剪刀剪去一小块，用其新鲜切面在载玻片上压印或涂抹成一薄层。 C 干燥：一般采取自然干燥法。 D 固定：火