叶俊杰11307110071细胞色素c突变体蛋白的催化反应动力学测定..docxVIP

细胞色素c突变体蛋白的催化反应动力学测定叶俊杰 11307110071一、实验目的1．了解酶的结构对其性质与催化功能的影响。2．熟悉Stopped-flow光谱仪测定酶反应动力学常数的原理与仪器使用方法。3．掌握酶催化反应动力学参数的计算方法。二、实验内容天然的细胞色素c只具有很低的催化活性。我们对细胞色素c进行了基因工程改造，使其具有与过氧化物酶相似的催化中心，得到了具有高过氧化物酶活性的细胞色素c突变体蛋白。本实验选取邻甲氧基苯酚 (2-methoxyphenol, guaiacol) 作为催化反应底物，用Stopped-flow光谱仪测试细胞色素c突变体蛋白的催化活性。邻甲氧基苯酚 (2-methoxyphenol, guaiacol) 作为细胞色素c突变体蛋白的催化反应底物时，其氧化产物为邻甲氧基苯酚四聚体 (tetraguaiacol)，如下式所示：邻甲氧基苯酚四聚体 (tetraguaiacol) 在波长470nm左右具有特征吸收，监测470nm的吸收即可对催化反应进行监测。Cytc突变体蛋白催化氧化guaiacol时，产物的典型生成曲线如下图所示，反应呈现四个阶段：首先是一个初始的活化阶段I (Activation phase, I)，然后是一个稳态时期 (Stead-state phase, II)，如曲线 (II) 直线部分所示。接着是一个反应速率下降阶段 (III)，最后是反应产物的降解 (IV)。最后两阶段的出现是由于反应产物tetraguaiacol不稳定以及催化剂失活所致。由于初始活化阶段的存在，反应初速率不能获得，所以稳态反应速率是对产物生成曲线求一阶微分后取其最大值 (即第二阶段直线部分的斜率)。Figure:A typical formation curve of guaiacol oxidation product, tetraguaiacol, catalyzed by cytochrome c variant monitored at 470 nm. Conditions: 1 μMWT Cytc, 100μMguaiacol, 200mM H2O2 in100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) at 25.0 ± 0.1 ?C. (Inset) The first 10-second curve of the product formation. The four phases, labeled I–IV, are explained in text.Figure: The sample handling unit front view (A) and stopped-flow system (B) of SF-61 DX6 Stopped-flow spectrometer.催化反应动力学实验在SF-61 DX2 Double-Mixing Stopped-Flow光谱仪 (英国 High-Tech Scientific Company, Dead time is 1 ms) 与计算机联用设备上测定。样品混合及数据处理通过计算机完成，温度通过与进样系统相连的超级循环恒温水浴装置控制。首先在下图所示的样管A中注入ddH2O或者相应的Buffer溶液，排除体系中的空气并进行空白扫描。然后在进样管C和D中注入待混合的样品溶液，关闭阀门后 (Drive/fill valve)，通过计算机程序施加 ~4 bar (4 Kg/cm2) 的气体压力于推动板 (Drive 2 inFig. B)，推动板推动进样活塞C和D中的溶液等体积快速注入石英混合器 (10 × 1.5 ×1.5 cm) 中进行反应，并记录反应产物在特定波长处的吸收随时间的变化曲线，对曲线进行拟合可得催化反应速率。三、实验步骤1、首先在一个5 mL离心管中用浓度为100 mM的磷酸盐缓冲液 (pH 7.0) 配制浓度为2 μM的蛋白溶液，加入一定浓度的guaiacol作为反应底物。在另一个离心管中用同样的缓冲液配制特定浓度的H2O2溶液。2、在上图所示的C管中装入Cytc蛋白和guaiacol的混合液，在D管中装入H2O2溶液，在25±0.1 oC保温5 min后，启动计算机程序施加 ~ 4 bar的氮气压力于推动板，使两溶液在光谱仪混合器中快速混合进行反应，并检测470 nm处的吸收随时间的变化曲线，用仪器自带的数据处理软件 (KinetAsyst) 对曲线进行拟合可得催化反应速率。同一实验条件下的数据均为3-5次重复实验所得结果的平均值。3.、测定guaiacol浓度在1-200 μM范围内变化的反应动力学参数。四、实验结果将所得的数据用公式：进行拟合。当底物浓度为250时，反应体系吸光度随