RT-PCR详细图文解析..docxVIP

一、实时荧光定量PCR原（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。（二）实时原理1、常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。2、实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析?3、如何对起始模板定量？?通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.4、几个概念：（1）扩增曲线：（2）荧光阈值：（3）Ct值：?????CT值的重现性：5、定量原理：理想的PCR反应：?? X=X0*2n非理想的PCR反应：? X=X0 (1+Ex)n????? n：扩增反应的循环次数????? X：第n次循环后的产物量????? X0：初始模板量????? Ex：扩增效率5、标准曲线6、绝对定量1）确定未知样品的 C(t)值2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量7、DNA的荧光标记：二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍方法一：SYBR Green法（一）工作原理1、SYBR Green? 能结合到双链DNA的小沟部位?2、SYBR Green? 只有和双链DNA结合后才发荧光3、变性时，DNA双链分开，无荧光4、复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。PCR反应体系的建立及优化:?1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测?　　2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准?　　3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物　　4、反应Buffer 体系的优化　　5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定　　?6、其他与常规PCR相同（二）应用范围1、起始模板的测定；　　2、基因型的分析；　　3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。（三）优点及缺点优点：对DNA模板没有选择性；适用于任何DNA；使用方便；不必设计复杂探针；非常灵敏；便宜。?缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件；?? 对引物特异性要求较高。方法二：TaqMan---水解型杂交探针?**5′端标记有报告基团(Reporter, R)? ，如FAM、VIC等?　　**3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)　　** 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光， R与Q分开，发荧光　　**Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针（一）工作原理?注意：每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光PCR反应的建立：1、引物、探针的设计：?探针Tm为68-70℃，30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，　　引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60℃2、反应参数的确定：一般为：94 ℃，10-20S　　?60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高）　　?也可通过温度梯度优化退火温度72 ℃，45 S，3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，信号/背景比值的最大值?　　引物浓度：50-900nM　　?探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同（二）优缺点优点：　　对目标序列的高特异性??????　　? ------阴性结果确定　　设计相对简单??????　　 ------与目标序列某一区域互补　　重复性比较好缺点：　　只适合一个特定的目标;　　委托公司标记，价格较高;　　不易找到本底低的探针