探析苍术挥发油对成骨样细胞增殖的作用.docVIP

探析苍术挥发油对成骨样细胞增殖的作用　　摘要：目的研究苍术挥发油对成骨样细胞UMR-106的增殖作用。方法苍术挥发油和UMR成骨样细胞体外共同培养,用MTT 法检测细胞增殖。结果挥发油在0.001 mg/ml 培养48h具有最强的促进细胞增殖作用。结论苍术挥发油中可能含有促进成骨细胞增殖的活性成分。 　　关键词： 苍术挥发油 增殖作用 成骨样细胞UMR－106 MTT 法 　　苍术（Rhizoma atratylodes）为菊科植物南苍术Atractylodes lancea ( Thunb.) DC.或北苍术Atractylodes chinensis Koidz.等的干燥根茎。苍术性辛、苦、温，归脾、胃、肝经，具有燥湿健脾、祛风散寒、明目作用。主治脘腹胀满、泄泻、水肿、风湿痹痛、风寒、感冒等［1］。 　　苍术在中医临床中使用十分广泛。已有研究发现苍术挥发油增加去卵巢雌性大鼠的骨钙含量（闫雪生《苍术油软胶囊的研制》。山东中医药大学硕士学位论文，2002），但对苍术挥发油是否影响成骨细胞的增殖，尚未见报道。本实验研究苍术挥发油对成骨细胞UMR-106的增殖作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　苍术药材购自上海德康药业有限公司,经中国人民解放军第二军医大学药学院生药教研室黄宝康副教授鉴定为苍术Atractylodes lancea (Thunb.) DC.的干燥根茎。 　　1.2 试剂　 　　DMEM 培养基(Cibco)；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基-四唑氢溴酸盐MTT(Sigma)；胎牛血清FBS(杭州四季青生物工程材料研究所)；胰蛋白酶(Cibco)；其它试剂均为国产分析纯。 　　1.3 方法 　　1.3.1 挥发油样品的制备水蒸气蒸馏法：将药材样品粉碎过40目筛，精确称取200 g的苍术，加水浸泡1 h，然后用挥发油提取器按常规水蒸气蒸馏，提取直至挥发油的量不再增加，蒸馏液用正己烷萃取，萃取液用无水硫酸钠干燥，过滤，微热蒸去溶剂得挥发油样品，挥发油样品为淡黄色透明油状物，具有刺激性气味。取50 mg挥发油样品溶于1 ml二甲基亚砜中，用灭菌过的0.2 mm 滤器( Gelmann Sciences) 除菌,并于4℃保存，备用。临用时用DMEM培养液稀释至所需浓度。 　　1.3.2 成骨样细胞UMR－106的培养［3］UMR－106 (大鼠成骨肉瘤细胞系) 细胞株获赠于江苏镇江医学院病原生物教研室,源于美国麻省医学院。将UMR-106细胞培养于10％胎牛血清（100KU/L青霉素，100 mg/ml链霉素）的无菌DMEM培养基中，置37℃,5%CO2培养箱中进行培养。取生长状态良好的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化，加含胎牛血清的培养基制成细胞悬浮液，调整细胞浓度为5×106个/ml接种于100 ml培养瓶中，二氧化碳培养箱中孵育，2～3 d换液1次。 1.3.3 MTT 法测定细胞的增殖［2］取对数生长期细胞消化计数后,用含血清的DMEM 细胞培养液将细胞浓度稀释至1×105个/ml ,铺入96孔细胞培养板中(100 μl/孔)培养24 h后加入含不同浓度挥发油(每个浓度6孔)的无血清DMEM培养。结束培养4 h前弃去培养液,每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml,用PBS配制)继续孵育4 h,有蓝紫色沉淀生成,每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO) ,振荡10 min待沉淀完全溶解,用酶标仪以550 nm 为测定波长、650 nm为参比波长测定吸光值,以不加中药的细胞孔测得的吸光值为空白,用t检验进行各加药组与空白组之间均值的比较。细胞增殖率的计算如下： 　　增殖率（%）= Ai实验组- Ao对照组Ao对照组×100% 　　Ai：不同条件下的吸光值；Ao：空白组的吸光值 　　2 结果 　　2.1 MTT 法测定细胞增殖与吸光度的关系将UMR-106细胞分别以6个不同浓度(1×105～1.2×106个)铺入96 孔板,培养8 h贴壁后,用上述方法测定每孔吸光度(Y),与细胞数目(X)作线性回归,得标准曲线方程：Y=0.054+0.092 6×10-6X(r=0.986 0,n=6),两者具有良好的线性关系。见图1。 　　2.2 挥发油对细胞增殖的作用用1，0.1，0.01，0.001 mg/ml 4种浓度的挥发油作用于细胞24 h，在λ＝550 nm测定其吸光值。结果见表1 。表1 不同挥发油浓度对UMR-106的增殖作用(略) 　　苍术挥发油浓度0.001 mg/ml时培养24 h，可明显促进细胞的增殖,细胞的增殖率为10.44%。在低的浓度下对细胞增殖有轻微的抑制作用,表明挥发油短期内使用低浓度较好。 　　为了观察挥发油促细胞增殖的最适宜的作用时间,用浓度为