基因工程综合性教学实验..docVIP

基因工程综合性教学实验 大肠杆菌碱性磷酸单酯酶基因 克隆 表达 纯化 吴海珍 王善利 赵健 俞建瑛 张惠展 华 东 理 工 大 学 应用生物学系 二○○五年一月 第一部分 碱性磷酸单酯酶基因的 定位、克隆与表达 实 验 流 程 图 碱性磷酸单脂酶基因在染色体DNA上的杂交定位――Southern Blotting 碱性磷酸单脂酶基因的体外扩增――PCR扩增 PCR体外扩增片段的克隆连接于T-载体――连接 连接产物转化大肠杆菌受体菌――转化 转化子质粒DNA的抽提――快速法制备质粒 转化子的鉴定――限制性内切酶酶切 目的转化子DNA的大量制备――碱法抽提质粒DNA 酶切回收克隆的目的基因片段――回收目的基因 重组表达型质粒的构建――连接、转化、鉴定 重组大肠杆菌目的蛋白的表达――蛋白电泳 实 验 路 线 1 DNA的酶切 摘要 本单元主要介绍限制性核酸内切酶的各种特性、酶的保存方法和使用注意点，多种酶联合酶切的常用策略等。 1.1实验原理 DNA重组技术中的第一步是从不同来源的DNA（染色体DNA或质粒DNA）上将待克隆的DNA片段特异性切下，同时在载体DNA分子（一般为质粒DNA