研究青天葵活性部位的体外抗肿瘤作用.docVIP

研究青天葵活性部位的体外抗肿瘤作用　　摘要：目的确定广西特产药材青天葵体外抗肿瘤作用的活性部位。方法青天葵部位提取物的制备主要采用溶剂法, 青天葵全草先用95%的乙醇提取，得到的提取物进一步用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇、甲醇依次提取，得到极性由小到大的4个提取部位。活性筛选采用MTT法实验，观察青天葵提取物对7种肿瘤细胞的生长抑制作用。结果青天葵石油醚和醋酸乙酯部位具有一定的体外抗肿瘤作用。结论首次确定了青天葵的石油醚和醋酸乙酯部分是体外抗肿瘤作用的有效部位。 　　关键词： 青天葵 体外抗肿瘤作用 活性部位 　 　　青天葵为兰科Orchidaceae植物毛唇芋兰Nervilia foadii(Hance) Schltr.的干燥全草，入药始载于《岭南采药录》，主要产于我国的广西、广东、海南，四川、云南，泰国也有分布，是广西特产药材［1～3］，具有清肺止咳、健脾消积、镇痛止痛、散淤消肿、清热解毒之功效，主治肺痨、咳嗽咳血、中毒、跌打损伤、小儿疳积、精神病、口腔炎、急性咽喉炎等症。近来还用含有青天葵的复方制剂治疗鼻咽癌以缓解症状［4］，但未发现国内外对其抗肿瘤有效成分及药理作用的研究。为此，笔者对青天葵的干燥全草进行了药效学实验研究，对青天葵的石油醚、氯仿、醋酸乙酯、甲醇4个不同部位采用体外抗肿瘤实验进行初筛，为阐明青天葵的抗肿瘤作用并筛选出有效部位打下基础。现报道如下。 　　1 材料与仪器 　　1.1 受试样品 　　药材青天葵来源于南宁药材站，经广西中医学院刘寿养副教授鉴定为兰科Orchidaceae植物毛唇芋兰Nervilia foadii(Hance) Schltr.的干燥全草。对青天葵的干燥全草进行提取分离得4个部位：石油醚提取物（A）、醋酸乙酯提取物（B）、正丁醇提取物（C）、乙醇提取物（D）。A，B，C和D均用含有DMSO的培养液溶解，均配成浓度为480 μg/ml的溶液，置于-20℃冰箱密闭避光保存。临用前用不含血清和抗生素的RPMI1640（NG108-15用DMEM）液稀释至所需浓度，DMSO终浓度在0.01%水平。 　　1.2 培养液 　　1.2.1 RPMI完全培养液含RPMI1640培养基（GIBCO）、3%谷氨酰胺、卡那霉素750 μg/ml、10% FBS（临用前加）。 　　1.2.2 DMEM完全培养液含DMEM培养基（GIBCO）、卡那霉素750μg/ml、10%FBS（临用前加）。 　　1.3 细胞株 白血病细胞株L1210和P388D1、宫颈癌细胞株Hela、人胃癌细胞株SGC7901、黑色素瘤细胞株B16、神经肿瘤细胞株NG108-15等均购自上海细胞生物研究所细胞库，人肝癌细胞株Hela7404由广西医科大学药理教研室提供。 1.4 试剂 　　MTT（四甲基噻唑蓝）为德国Sigma公司产品，批号020609；FBS（胚胎牛血清）为美国Hyclone公司产品，批号0405；RPMI1640和DMEM培养基为GIBCO公司产品，批号1120708和0311；Trypsin（胰蛋白酶）由天津市灏洋生物制品有限责任公司提供，批号XX03；DMSO（二甲基亚砜）由天津汇英化学试剂有限公司提供，批号XX0526。 　　1.5 细胞培养肿瘤细胞用含10%灭活新生小牛血清的RPMI1640（NG108-15肿瘤细胞用DMEM）培养基在37℃，15%CO2条件下培养，取对数生长期细胞用于实验。 　　1. 6 仪器 　　Thermo Forma型CO2培养箱，美国产；Olympus型倒置显微镜，日本产；Biocell型酶标仪，奥地利产；AG135型电子天平，瑞士产；培养瓶，美国产；3072型96孔板，丹麦产；3001型培养皿，美国产；DLF560型超净工作台，荷兰产；HV-50自动高压灭菌器，日本产。 　　2 方法 　　2.1 样品的提取分离 　　将青天葵药材阴干，去除杂质，粉碎为粗粉，称取9.0 kg药材粗粉，用95%乙醇（食用）浸泡48 h后渗滤提取，用10倍量乙醇提取。合并乙醇提取液，减压回收乙醇，得粗提物，干燥后得921.3 g（得膏率10.2%）。将所得的粗提物用硅胶拌匀后，依次用石油醚（60～90℃）、醋酸乙酯、正丁醇、甲醇回流提取，回收溶剂，得石油醚部位180 g，醋酸乙酯部位87.5 g，正丁醇部位86 g，甲醇部位50 g。 　　2.2 MTT法 　　取对数生长期细胞以0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化后，用培养液稀释。在96孔培养板中每孔加入200 μl（含有5 000个/ml肿瘤细胞）含10%FBS的RPMI1640培养液，NG108-15细胞则用含10%FBS的DMEM培养液，细胞置37℃，10%CO2培养24 h后，实验组分别加入最终浓度为15，30，60，120，