SSH抑制性消减杂交文库构建介绍..docVIP

SSH抑制性消减杂交文库构建方法介绍SSH是一项可以快速获取两个不同生物材料中差异表达基因的分子生物学技术，是快速筛选差异表达基因的有效方法，也是寻找新基因的重要手段。该技术尤其适合以genome尚不完全清晰的物种或者以特殊材料为研究对象的科研工作者。是基因芯片技术的有效补充。 ,除了基因组计划中从全基因组测序水平进行结构与染色体位置研究外,从表达序列水平进行研究,是研究结构基因的快捷方式。因为基因组中编码的表达基因只占全基因组的3 %～5 % ,而某一时期的基因表达一般又只占全部基因的15 %。构建cDNA 文库,是从表达水平研究基因的基本内容。由于基因表达频率的不同,高拷贝的mRNA 每种有数千个,而与分化及特定代谢相关的基因则只有几个拷贝,所以用普通cDNA 文库(Conventional cDNA library) 进行基因差异表达或用探针筛选目的基因的研究,是一劳动强度大、效率低而不经济的方法。虽然近年来出现了均等化cDNA 文库(Normalized cDNA library) 来解决文库中基因高丰度的问题,但某一时期生物体在组织细胞中表达的基因成千上万种,确定哪个与要研究的问题直接相关,这给判定及发掘特定功能中的相关基因带来困难。差减文库的出现则避免了上述两种cDNA 文库在基因差异表达研究上存在的问题,该技术自80 年代初产生以来有了许多改进与发展。 基本流程:通过差减文库构建，文库验证和筛选（逆向斑点杂交），获得阳性克隆，对阳性克隆测序及生物信息分析，可判定差异基因的情况。另外结合RACE技术可进一步克隆所获得的差异基因的cDNA全长序列，并可用Northern blot 或Real－Time PCR加以验证。抑制性消减杂交文库技术是一种革命性的差异表达基因筛选技术。该方法结合了抑制性PCR和消减杂交技术，即御用PCR反应链内退火有限于链间退火的特点和分子杂交二级动力学原理，经过体系不断优化建立起来的快捷、有效的差异基因筛选方法。与传统的DD—PCR、SAGE及cDNA—RNA等技术相比，具有低丰度mRNA富集效率高、假阳性低、灵敏度高重复性好等特点。现已广泛应用于动植物发育和分化、疾病易感性差异、抗药性差异和组织（病理和正常样本）差异及微生物基因分型差异的研究。 技术方法成熟有效不需要利用传统的物理方法对单链、双链cDNA进行分离。只要目的序列存在，就能进行指数扩增，筛选出差异基因片段。 放大稀有转录本本技术在同一操作下完成转录本丰度平衡和差减，在我们的模型实验中，稀有转录本至少被放大了5000倍，也就是说，利用本及时可以极大地增加获得表达差异地稀有转录本地可能性。 仅仅需要500ng的poly A＋ RNA 与其他的消减杂交方法不同，应用抑制性消减杂交技术只需要0.5－2的poly A+ RNA即可进行有效实验。如果您只有极少量（50ng-100ng）的总RNA，我们可以通过poly A＋ RNA的高保真线性放大技术来合成足量的cDNA来进行抑制性消减杂交实验。寻找差异表达的基因有不少方法，抑制消减杂交（SSH）是比较有效的一种方法。以Clontech的PCR-Select cDNA Subtraction Kit为例：将样品（tester）和对照（driver）的mRNA分别反转录并合成为双链cDNA后进行酶消化；样品（tester）分为两组，分别加上不同的adaptor1/2；再将两组样品（tester）分别与过量的对照（driver）杂交，两份杂交结果混合，加入过量的对照再进行第二轮杂交；补齐adaptor然后用PCR选择性扩增。由于过量的对照封闭了在样品中共同表达的基因，而在样品中特异表达的基因会被选择性地扩增出来，这些扩增的片断经过克隆 、测序后可以进行拼接或者用RACE的方法从已知片断钓全长cDNA，再做进一步的分析。 差减杂交是构建差减文库的核心,差减文库是否构建成功很大程度上决定于差减杂交的效率。