WesternBlot试剂的准备..doc

Western Blot试剂的准备 1. 30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）? ?? ?? ?? ? 29.0g　　　　　　　　　　　亚甲双丙烯酰胺（Bis）? ?? ???1.0g　混匀后ddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。 2. 4×分离胶缓冲液（1mol/L Tris-HCl??PH 8.8）? ?Tris??18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 8.8，定容至100ml。 3. 4×浓缩胶缓冲液（0.5mol/L Tris-HCl??PH 6. 8）? ? Tris??12.1g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 6. 8，定容至100ml。 4. 10%SDS：电泳级SDS 10.0g加ddH2O，68℃助溶，浓盐酸调PH 7.2，定容至100ml。 5. 5×电泳缓冲液（PH 8.3）：? ???Tris? ?? ? 15.2g? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?甘氨酸? ? 94g??? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?ddH2O? ???定容到1000ml? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?SDS? ?? ? 5g　　先在974ml蒸馏水中加入Tris碱，待溶解完全后，再加甘氨酸，最后加SDS。 6. 10%过硫酸铵（AP）：0.1g??AP加ddH2O至1.0ml，4℃保存，要在一周内使用，最好新鲜配制。 7. 2×加样缓冲液：2×SDS加样缓冲液　　　0.5mol/L Tris-HCl (PH 6.8)??2ml　　　10%SDS? ?? ?? ?? ?? ?? ?4 ml　　　β-巯基乙醇? ?? ?? ?? ?? ?1ml　　　甘油? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ? 2ml　　　1%溴芬蓝? ?? ?? ?? ?? ???1ml　　　置4℃避光保存 8. TEMED：注意室温较低时TEMED量可加倍，最后灌胶之前再用 9. 转膜缓冲液(Towbin transfer Buffer)：即1×SDS 10. 0.0 1mol/L PBS (PH 7.4) ：? ?? ?NaCl? ?? ?? ?? ???8.5g　　　　　　　　　　　　　　　(12H2O)Na2HPO4? ???2.9011g　　　　　　　　　　　　　　　(2H2O)NH2PO4? ?? ?? ?0.24g　　　　　　　　　　　　　加ddH2O定容至? ?? ? 1000ml 11. 封闭液:? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ???1×PBS中加入? ?? ?? ?? ?? ? 30ml　　　　　　　　　　　5%（V/V）脱脂奶粉? ?? ?? ???1.5g　　　　　　　0.02%叠氮钠? ?? ?? ?? ?? ? 0.006g　　　　　　　0.05%Tween-20? ?? ?? ?? ???0.015g 12. 漂洗液（PBST）：含0.05% Tween-20的PBS溶液　　每1000 ml PBS溶液中加0.5 ml Tween-20 13. 水饱和正丁醇：正丁醇? ? 50 ml　　　　　　　　　ddH2O? ?? ?5 ml? ???加入瓶中震荡，使结合，存于室温。　　用时取上面一相加在凝胶上面。 14. 考马斯亮蓝染色法试剂：一般用G250考马斯亮蓝（蛋白定量专用）染色液： 90 ml甲醇：水（1：1，V/V）和10 ml冰乙酸的混合液中溶解G250马斯亮蓝0.25g，用Whatman 1号滤纸过滤染液以去除颗粒状物质。（染色液多次回收利用）　　　　　　　　　脱色液：90 ml甲醇：水（1：1，V/V）和10 ml冰乙酸的混合液 15. 丽春红S染色色法试剂：2%乙酸，　　　　　　　　　　　　　0.5%丽春红的水溶液　　脱色液：TBS 16. Aprotinin:为一58氨基碱性多肽，经反复冻融后，会发生集聚，储存液应分装成小份，保存于-20度，每一小份用后应予废弃。 17. PMSF：在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量的水冲洗。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。PMSF通常配成10mmol/L浓度储液（1.74或17.4mg/ml溶于异丙醇中）保存于-20度。 18. 显色液：联苯胺显色液（DAB）　　　　　DAB? ?? ?? ?? ?? ???2ml　　　　　10%H2O2? ?? ?? ?? ?? ?? ? 60μl　　　　　PBS(0.1mol/L PH6.4)? ?10ml 19.