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基因工程第五章 第五章 基因的体外重组和转化 第一节 DNA片段的体外连接 第二节 重组体导入细菌细胞 一、黏性末端的连接 黏性末端连接(Cohesive end ligation)： 具有黏性末端的两个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下, 连接成为一个杂合双链DNA。 优 点 ?经济省时，操作方便； ?外源片段容易回收； 问 题 ?载体自身环化 ?插入片段可双向插入 2.不同限制酶酶切产生黏末端的连接 ?载体和目的基因分子上有两个相同的酶切位点 ?载体和目的基因只有一个相同的限制酶识别位点 ?无相同的限制酶识别位点，有同尾酶 SalⅠ片段（CAGCTG） XhoⅠ 片段(GAGCTC) ?若均不是以上情况呢？ 二、平末端的连接 平末端连接(blunt end ligation)： 在T4DNA连接酶的作用下，将两个具有平末端的双链DNA分子连接成杂种DNA分子。 优 点 可以用T4连接酶连接任何DNA平端 ?5’-突出粘性末端的补齐 可用Klenow聚合酶补齐 ?3’-突出粘性末端的削平 可用T4 DNA聚合酶削平 主 要 问 题 连接效率低 ?高浓度的底物和T4 DNA连接酶 ?添加凝聚剂：如聚乙二醇 不易回收外源DNA片断 双向插入 三、修饰黏末端连接 ?同聚物加尾法： 同聚物加尾(homopolymer tails joining)连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3’端各加上一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端, 然后在DNA连接酶的作用下, 连接成为重组的DNA。 优 点 ①不会发生自身环化作用； ②连接效率较高； 存在问题 ?操作繁琐 ?外源片段难回收 ?可能会影响基因表达 ?衔接物连接法 衔接物（linker）是指用化学方法合成的一段由8～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。 ?DNA接头法： DNA接头（adapter）是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。 ?讨论 如何将一平末端的DNA片段与BamHⅠ形成的粘性末端连接？（P156.4） 四、PCR产物的连接 1.限制性内切酶酶切位点引入法 ?在引物上添加或引入限制酶识别位点，使PCR产物两端带有相应的限制酶识别位点，进一步与相应载体进行连接。 ！！注意 ①添加保护序列 ?Primer1: 5’ GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA ?Primer2: 5‘ GCGGggatccTCTTGTACAGCTCGTCCATGCC ②引入的酶切位点是单一的 （2）利用突变在引物5‘端引入酶切位点 通过在PCR引物序列的5’端突变一个或几个碱基，创造出限制酶识别位点的方法。 2.T-A克隆 利用嗜热聚合酶如Taq聚合酶的模板非依赖性末端转移酶活性 百度搜索“就爱阅读”,专业资料,生活学习,尽在就爱阅读网92,您的在线图书馆(在70～75℃活性高)，使PCR产物的3′末端加一个A的粘性端，将其直接克隆至3′粘性末端含一个T的线性克隆载体中. ?T载体的构建： ?用限制性内切酶如XcmI, HphI, 与MobII 酶切产生3‘末端未配对的T； ?应用末端转移酶与双脱氧TTP加入一个突出的T残基到线形化载体的3’末端。 ?应用不依赖末端的Taq DNA聚合酶的末端转移酶活性在线形化载体的3‘末端出的羟基基团上催化连接上一个T碱基。 五、Gateway载体构建系统 Gateway技术： 一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。 Gateway技术的灵活性： ?整合后的附着位点为 attL（BOP’） attR（POB’） ?整合位点---attB attP 切除位点---attL attR ?整合过程需要介导蛋白和重组位点。 第二节、重组体导入细菌细胞 ?转化(transformation):受体细胞捕获并表达质粒DNA的生命过程； ?转染(transfection):受体细胞捕获并表达噬菌体DNA的生命过程； ?转导(transduction):重组体包装成噬菌体导入受体细胞的过程。 一、大肠杆菌感受态的制备 感受态：细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态就称为感受态。 1970年Mandel和H