实验五高效液相色谱法测定蛇葡萄属植物黄酮的含量..docVIP

实验五 高效液相色谱法测定蛇葡萄属植物黄酮的含量 一、目的要求 1、了解高效液相色谱法分离测定样品含量的实验原理及测定方法。 2、了解高效液相色谱仪的主要组成、操作要点及其维护知识。 二、实验原理及相关知识 高效液相色谱法又称高压液相色谱法。是20世纪60年代末，在经典液相色谱（采用普通规格的固定相及流动相常压输送的液相色谱）的基础上，引入气相色谱的理论和实验方法，流动相改为高压输送、采用高效固定相及在线检测手段发展起来的一种分离分析方法。高效液相色谱法与经典液相色谱法相比具有：适用性广，分离性能好，测定灵敏度高，分析速度快，流动性可选择性范围宽，色谱柱可反复使用，分离组分易收集等特点。 高效液相色谱仪主要组成 高效液相色谱仪由输液泵、进样器、色谱柱、检测器及数据处理系统等组成，其中输液泵、色谱柱及检测器是仪器的关键部件。 高效液相色谱类型 高效液相色谱法类型按色谱的分离模式有多种，其中正相色谱、反相色谱、离子交换色谱是常见的几种色谱法。正相色谱流动相的极性小于固定相的极性的液相色谱法；反向色谱流动相的极性大于固定相的极性的液相色谱法；离子交换色谱以离子交换剂为固定相，用缓冲溶液为流动相，靠选择性系数差别而分离的离子交换液相色谱法。 高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液体以提高分离速度，采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。 高效液相色谱对流动相的基本要求 （1）不与固定相起反应；（2）对样品有适宜的分离度；（3）必须和检测器相适应；（4）黏度要小。 组分分离时对流动相的选择： （1）溶剂的极性：正相色谱中，溶剂的极性越大，其洗脱能力就越强；反响色谱中，溶剂的极性越大，其洗脱能力越弱； （2）流动相选择的原则：在正相色谱中，可先选用中等极性的溶剂作为流动相。观察组分保留时间的长短，调整合适的流动相。常采用乙烷、庚烷、异辛烷、苯、二甲苯等有机溶剂作流动相，必要时还加入一定量的四氢呋喃等极性溶剂。在反向色谱中，流动相一般以极性最大的水作为主体，然后按比例加入适量有机溶剂而成。常用的洗脱剂包括水、乙睛、甲醇、四氢呋喃等。洗脱液洗脱能力的强弱顺序：水（最弱） 甲醇 乙睛 乙醇 四氢呋喃 二氯甲烷（最强）。二氯甲烷不溶于水，常用于清洗被强保留样品污染物的反相柱。为得到低的柱压，首选乙睛，其次是甲醇，再之是四氢呋喃。离子交换色谱的流动相通常采用具有一定pH的缓冲溶液。必要时可在流动相中加入甲醇以增加某些酸碱物质的溶解度，有时也可改变盐的浓度，以控制离子强度，减小某些样品组分的脱尾现象，从而使分离效果得到改善。 高效液相色谱的固定相 高效液相色谱的固定相是对色谱柱中的固定相而言，它直接关系到柱效与分离度。常用的液固色谱固定相有硅胶和化学键合相。化学键合固定相是将各种不同的有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上形成的一种高效液相色谱固定相载体，使色谱柱具有柱效高、使用寿命长、重现性好的特点。 化学键合相根据极性可分为（1）非极性键合相：这类键合相表面基团为非极性烷基，如十八烷基、辛烷基、乙基、甲基苯基，可作反相色谱的固定相。常用的有十八烷基键合硅胶（ODS或C18）、辛烷基（C8）键合相、苯基键合相。（2）中等极性键合相：常见的是醚基键合相，其既可作正相色谱有可作反相色谱的固定相。（3）极性键合相：常用氨基、氰基键合相为极性键合。如分别将氨丙硅烷基及氰乙硅烷基键合在硅胶上制成用作正相色谱的固定相。氨基键合相是分离糖类常用的固定相。在高效液相色谱中， 70%~80%的分析任务皆由反相键合相色谱来完成的。 高效液相色谱分析法的洗脱方式 色谱分析系统分离时，常用等度洗脱和梯度洗脱两种方式。梯度洗脱具有单位时间的分离能力增加，检测灵敏度提高的优点。 蛇葡萄属植物黄酮经甲醇溶液溶解，经高速离心分离，微孔滤膜过滤后直接进样，用C18反相色谱柱分离，经紫外检测器检测，与标准比较定量，用外标法计算含量。 三、仪器与试剂 （一）仪器 1、 高效液相色谱仪，美国waters 公司 2、超声波脱气装置 3、高速离心机 4、0.45μm 滤膜过滤器（滤头、滤膜及注射器组成） （二）试剂 1、乙睛（色谱纯） 2、二次蒸馏水 3、冰醋酸（AR） 4、流动相：乙睛-水-醋酸（ 1：9 ：0.1）混合液。临用时超声波脱气处理10min。 5、3,5,7,3’,4’,5’–六羟基–2,3–双氢黄酮标准贮备液：称取50mg (0.0001g)标准样品，用甲醇溶解至50mL，高速离心，用0.45μm 滤膜过滤，备用。此时溶液浓度为1mg/mL。 四、实验步骤 （一）样品溶液配置 称取蛇葡萄属植物黄酮提取物50mg (0.0001g)，用甲醇溶解至100