氨基酸聚酰胺薄膜层析..doc

氨基酸聚酰胺薄膜层析——DNS-Cl法 一、实验目的： 1．掌握聚酰胺薄膜层析技术的基本方法和应用。 2．熟悉蛋白质及肽的N末端氨基酸DNS分析法。 二、实验原理： .1.层析技术 ①概念：是利用化合物中各组分的物理性质的差别（如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分子极性等）使各组分在两相中的分布不同，从而使各组分以不同速度随流动相向前移动而达到分离的目的。 ②特点：分离效率高，能分离各种性质相类似的物质。不仅可用于少量物质的分离纯分，也可用于大量物质的分离纯化和制备。 ③层析法的分类 气相层析（以气体为流动相的层析法） 液相层析（以液体为流动相的层析法，此为生物化学领域里常用的方法） I.吸附层析：薄层吸附层析、吸附柱层析 II.分配层析：纸层析、柱层析、薄层层析 III.离子交换层析 IV.凝胶层析：柱层析、薄膜层析 V.亲和层析 ④纸层析法(paper chromatography)是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。纸层析法是用滤纸为支持物进行层析的方法，所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成，滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。溶剂由下向上移动的，称上行法；由上向下移动的，称下行法。将样品点在滤纸上(此点称为原点)，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点距离不等的层析点。 溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示：Rf=原点到层析斑点的距离/原点到溶剂前沿的距离 在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。只要条件(如温度、展层溶剂的组成)不变，Rf值是常数，故可根据Rf值作定性判断。 样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的Rf值相同或相近，此时如只用一种溶剂展层，就不能将它们分开。为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转动90度，再用另一溶剂展层，从而达到分离目的，这种方法称为双向纸层析法。 氨基酸无色，可利用茚三酮显色反应，将氨基酸层析点显色作定性、定量用。 2.荧光试剂二甲氨基萘磺酰氯(dansyl-Cl，简称DNS-C1)在碱性条件下与氨基酸(肽或蛋白质)的氨基结合成带有荧光的DNS-氨基酸(DNS-肽或DNS-蛋白质)，DNS-蛋白质再经酸水解可释放出DNS-氨基酸。 DNS-C1能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物，其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成双DNS-氨基酸衍生物。这些衍生物相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度可达10－10～10－9mol水平，比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的FDNB法高100倍。将Edman法和DNS法结合起来(称为Edman-DNS法)应用于蛋白质结构的序列分析上作，可以提高Edman法的灵敏度及其分析速度。DNS-氨基酸衍生物在6mol/L盐酸中105℃水解22小时，除DNS-色氨酸全部被破坏，DNS-脯氨酸(77％)，丝氨酸(35％)，甘氨酸(18％)，丙氨酸(7％)部分被破坏外，其余DNS-氨基酸很少破坏。故DNS法可用于蛋白质和肽的氨基酸组成N末端分析。 DNS-C1与蛋白质的侧链基团巯基、咪唑基、ε-氨基和酚羟基反应，前两者在酸碱条件下均不稳定，酸水解时完全破坏；DNS-ε-赖氨酸和DNS-O-酪氨酸较稳定，同时还有DNS-双-赖氨酸和DNS-双-酪氨酸生成，层层后在层析图谱的位点上，都与DNS-α-氨基酸有区别。 聚酰胺是—类化学纤维原料，即锦纶(又称尼龙)。由己二酸与己二胺聚合而成的称锦纶66 。因为在这类物质分子中都含有大量酰胺基团，故统称聚酰胺。它对很多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的一C＝O及NH基能与被分离物质之间形成氢键。如酚类(包括黄酮类、鞣质等)和酸类如核苷酸、氨基酸等)是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键；硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形成氢键。被分离物质形成氢键能力的强弱，确定吸附能力的差异。在层析过程中，层层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。因此选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异，经过吸附与解吸的展层过程，可以一一分离。 三、实验用品： 1.实验器材 聚酰胺薄膜（7cm×7cm）、小钟罩、吹风机、小离心管、毛细管、紫外分析仪、小培养皿、移液枪 2.实验试剂 PH9.9 的标准赖氨酸、丙氨酸、苯丙氨基酸，混合氨基酸、展层液（以甲酸：水==1.5:100配制） 四、操作方法： 1.DNS-Cl标记PH9.9的标准氨基酸 取4个小离心管，分别加入三种标准氨基酸以及混合氨基