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基因工程 1. 基因工程的DNA聚合酶有几类？主要有哪些活性？ （1）依赖于DNA的DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）；大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）、耐热的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）等。 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）具有三种活性：①5’→3’DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3’自由羟基的DNA片段为引物；②5’→3’外切核酸酶活性，从5’端既降解双链DNA，也降解RNA-DNA杂交体中的RNA链（RNA酶H活性）；③3’→5’外切核酸酶活性，底物为带3’自由羟基的双链DNA或单链DNA。主要用于：①以切刻平移法标记DNA；②对DNA分子的3’突出尾进行末端标记。 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）5’→3’DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3’自由羟基的DNA片段为引物。3’→5’外切核酸酶活性，底物为带3’自由羟基的双链DNA或单链DNA。 Taq DNA聚合酶具有一种活性：5’→3’DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3’自由羟基的DNA片段为引物。 主要用于：①对DNA进行测序；②通过聚合酶链式反应对DNA分子的特定序列进行体外扩增。 （2）依赖于RNA的DNA聚合酶（即逆转录酶）: 优先以RNA为模板，也可以DNA为模板。逆转录酶能以RNA为模板催化合成双链DNA。 逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）具有两种活性：①5’→3’DNA聚合酶活性，以RNA或者DNA为模板，以带3’自由羟基的RNA或DNA片段为引物;②RNA酶H活性，即5’→3’ 外切核糖核酸酶活性，特异地降解RNA-DNA杂交体中的RNA。 逆转录酶无3’→5’外切核酸酶活性，即无校对功能，其催化的聚合反应容易出错。 (3)末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶）:不以DNA或RNA为模板，只是将核苷酸加到已有DNA分子的末端。 末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶）具有一种活性：即末端转移酶活性，在二价阳离子存在下，其催化dNTP加于DNA分子的3’-羟基端。 主要用于：①给载体DNA或cDNA加上互补的同聚尾; ②以32P标记的一种dNTP或一种rNTP来标记DNA片段的3’端。 2. 基因工程的大肠杆菌载体有哪些，各有什么特点？ 3. 琼脂糖凝胶电泳的原理？有什么特点？ 基本原理：在生理条件下，核酸分子之间糖－磷酸骨架中的磷酸基团呈离子化状态。当核酸分子被放置在电场中时，它们会向正电极方向迁移。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此，它们能以同样的速度向正电极方向移动，即电泳的迁移率，取决于核酸分子自身的大小和构型。 特点：（1）琼脂糖是一种线性多糖聚合物，当其加热到沸点冷却凝固会形成良好的电泳介质，其密度由琼脂糖的浓度决定；（2）经过化学修饰的低熔点（LMP）的琼脂糖，在结构上比较脆弱，低温下熔化，可用于DNA片段的制备电泳。LMP可不经过电洗脱或破碎凝胶，用来回收DNA分子；（3）无毒，凝胶过程中不需要催化剂、加速剂，不会发生自由基聚合；（4）分辨率: 0.2～50kb。 4. 多聚酶链式反应（PCR）的基本原理？PCR反应体系的组成？ 基本原理：（1）在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，利用DNA聚合酶催化合成反应，体外扩增特异DNA片段。（2） 能够指导特定DNA序列的合成。（3）使特定DNA区段得到了迅速大量的扩增。 反应条件。94℃变性30s；55℃复性30s；70～72℃延伸30～60s。一共进行30轮左右的循环。 反应体系：（1）模板。待测的核苷酸（DNA或RNA）分子；双链DNA可直接用于反应，而RNA则需要用反转录酶反转录成为cDNA，然后用作聚合酶反应的模板。（2）DNA聚合酶。最初采用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段或T4 DNA聚合酶催化。由于每轮反应需要三个温度点，因此采用耐热TaqDNA聚合酶。（3）一对引物。人工合成的、长度通常为20～24个核苷酸。（4）四种三磷酸脱氧核苷（即dNTP），是合成DNA所需的原料。（4） 适当的缓冲液体系。用于PCR的标准缓冲液内一般含：50mmol/L KCl、10mmol/L Tris-HCl（pH8.3，室温）、 1.5mmol/L MgCl2。 5. 常用目的基因制备的方法及其原理？ 已知基因部分核苷酸序列或全部核苷酸序列，基因的制备方法主要分为两大类：一类是基因化学合成法，一类是基因生物制备法。一般又可将基因生物制备法分为基因组文库法、cDNA文库法和PCR法等。 （一）基因化学合成法 DNA的化学合成方法主要有磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亚磷酸酰胺法等。磷酸二酯法是最初发明的化学合成基因的方法，而固相亚磷