l液相操作讲义gere.pptVIP

高效液相色谱法应用讲座 台州市药品检验所 曾茂法 HPLC实验操作应知 HPLC操作操作流程 流动相的配制 色谱柱使用与维护 实验操作注意事项 检测器 数据处理 1 概述 定义 HPLC——用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。 仪器结构简介 仪器组成 根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统、柱后反应系统等。 泵 输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下性能：①流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定量的准确性至关重要；②流量范围宽，分析型应在0.1~10 ml/min范围内连续可调，制备型应能达到100 ml/min；③输出压力高，一般应能达到150~300kg/cm2；④液缸容积小；⑤密封性能好，耐腐蚀。 泵的使用和维护注意事项 ??? ①防止任何固体微粒进入泵体，常用的方法是滤过，输液泵的滤器应经常清洗或更换。??? ②流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。 ??? ③溶剂瓶内的流动相被用完。??? ④输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。 附：高效液相色谱仪流程图 1.2 HPLC分离模式与主要分离机制 正相色谱法与反相色谱法 正相色谱法?? 反相色谱法　 ???  正相与反相 正相色谱法???????? 反相色谱法固定相极性?????????高～中???????????? 中～低流动相极性?????????低～中???????????? 中～高组分洗脱次序???极性小先洗出? 极性大先洗出 正相：流动相极性↑，洗脱能力↑，k↓ ，组分tR↓ 反相：流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑ 1.3特点 适用范围宽：现在绝大部分化学类药品皆可采用该仪器分析。 分离效率高：复方分析、辅料干扰时等情况下，更显示其威力。 速度快：一般出峰时间均在30min以内。 灵敏度高：可检测物质达10-9g左右，一般最低检测浓度均可达10-1~10-3μg/ml（进样体积10~20μl）。并可通过使用不同的检测器，测定不同物质，或再提高测定灵敏度。 色谱柱可反复使用：一般保存好，均可达2年以上。 流出的组分容易收集：可用于制备色谱或价格极为昂贵的物质收集。 安全：仅有一些有机溶剂的污染（使用时，流动相口要密封，一者以免挥发，流动相中各组分比例不准，二者防止挥发，污染环境），比气相要安全的多。 1.4 思考 1、为什么说分离度与重复性是系统适应性试验指标中是更具有实用意义的参数？ 2、影响柱效的因素有哪些？ 3、影响分离度的因素有哪些？ 4、影响重复性的因素有哪些？ 影响分离的因素 1． 思考 psi、bar、Mpa如何换算？ 乙醇为什么不常用作流动相？ 2、HPLC操作操作流程 开机 最后开检测器 配制流动相 流动相平衡，在此过程和适当时候调节柱温、流速、流动相比例。必要时要选柱子。配制对照品、样品溶液。 系统适应性试验 进样 数据处理 关机 先关检测器，后冲洗 流动相的配制 流动相应具有的特点 流动相脱气 流动相过滤除去微粒 流动相贮存 流动相极性与截止波长 流动相调pH值 思考题 流动相具备以下的特点：?? a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。?? b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。?? c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。 d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。?? e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。?? 流动相为什么要脱气 流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用FLD，可能会造成荧光猝灭。  常用的脱气方法比较 氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。抽真空脱气法：易抽走有机相。 常用的脱气方法比较 超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15mi