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MTTassay.
MTT assay [预习用]用途： 1.MTT assay is laboratory test and standard colorimetric assay. 2.for measuring the activity of enzymes that reduce MTT to formazan(甲臜). 3.can also be used to determine cytotoxicity of potential medicinal agents.
原理： 1.Yellow MTT（黄色染料）is reduced to Purple formazan in living cells. ?? (活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。) 2.甲瓒不溶于水，但能溶于一些增容溶剂(solubilization solution)，如DMSO。 3.DMSO is added to dissolve the formazan into a colored solution 4.the absorbance of the colored solution can be quantified. 5.the wavelength of the absorbance is usually between 500 and 600 nm. (570nm/490nm in 酶标仪) 6.通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。
MTT溶液配制方法： 1.通常MTT的浓度为5mg/ml。 ?? 可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的PBS(or无酚红的培养基)中 2.用0.22μm滤膜过滤以除菌 3.4℃ 避光保存即可。 NOTE： 1.在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。往96孔板加时可以不避光，也可以把操作台上的照明灯关掉。 2.MTT最好现用现配. ?? 过滤后4℃避光保存两周内有效;或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存 3.避免反复冻融，最好小剂量分装 4.当MTT变为灰绿色时绝对不能再用 5.MTT有致癌性 6.MTT对细菌敏感
PBS配方： Nacl 8g/Kcl 0.2g/Na2HPO4 1.44g/KH2PO4 0.24g 调pH 7.4、定容1L （可定容后测pH约7即可）
实验方法：（用于贴壁细胞） 1.对数期细胞，调整细胞浓度，（每孔加入100ul,使待测细胞调密度至1000-10000孔），边缘孔用无菌PBS填充。 2.在5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底。 3.加入浓度梯度的药物 （原则上，细胞贴壁后即可加药，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药。） （一般5-7个梯度，每孔100ul，设5个复孔，否则难以反应真实情况） 4.在5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 5.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。 ?（若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。） 6.终止培养，小心吸去孔内培养液。 7.每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。 ? (pipette up and down to dissolve crytals.) ?（Put plate into the incubator for 5min to dissovle air bubbles.） 8.酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。 ? （用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。） 9.设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜） ?? 对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
方法限制和评价： 1.MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。 2.the effectiveness of the agent can be deduced through the dose-response curve(剂量反应曲线). 3.缺点：由于甲瓒不溶于水，使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响。 4.MTS is a more recent alternative to MTT.（colored in the presence of PMS） ??advantageous over MTT: (1) MTS + PMS are more efficiently than MTT (2) the product is water soluble, decreasing toxicity to
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