trizol法提取RNA..docVIP

植物总 RNA 的提取 抽提RNA 所用的研钵酒精灼烧5-10min.，其他器皿均用0.1%的DEPC 水处理，24hr. 后高温高压灭菌两次，以去除RNA 酶，所有试剂都保证没有RNA 酶污染。 1) 1.5ml 离心管中加入1ml Trizol，取0.1g 组织在液氮中研磨至粉末，加入到Trizol 中，立即充分混匀。 2) 将混匀的组织在 15-30℃放10min，使核酸蛋白复合体物完全分离。 3) 4℃，10000rpm 离心20min，取上清。 4) 加氯仿 200μl，5M NaCl 200μl，剧烈振荡15s，室温放置3min（或不放置，直接 离心）。 5) 4℃，10000rpm 离心20min，样品会分成3 层，取上层水相，取上清。 17 6) 加 500μl 异丙醇，混匀，室温放置10min。 7) 4℃，10000rpm 离心15min，去上清，管底管侧形成胶状沉淀。 8) 加 1ml 75%乙醇，洗涤沉淀，重复两次，洗涤用4℃，7500rpm 离心5min，弃上 清。 9) 吹干约 15min。 10) 加 50μl DEPC 处理的水，65℃溶解，-20℃（最好-80℃）保存。 DNase I 处理消化植物总RNA 中的基因组DNA 1) 取5μl 的植物总RNA，然后顺序加入1μl 10×缓冲液，1μl DNase，3μl RNase-free 水，总体积10μl，充分混匀后，37℃温育30 min。 2) 加入1μl 终止缓冲液，65℃温育10min，使DNase 失活。 反转录 cDNA 1) 在上述总体积为11μl 反应液中加入1μl Oligo(dT)18 引物4μl 5×缓冲液，2 μl dNTP， 1μl 反转录酶，1μl RNase 抑制剂，总体积20μl，充分混匀后，42℃温育1-1.5hr。 2) 70℃温育10min，终止反应 trizol法提取RNA 步骤2010年03月09日 星期二 17:07从组织中提取总RNA 1)液氮研磨，组织块直接放入研体中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮， 再研磨，如此三次，按50-100mg组织/mlTrizol加入Trizol，转移入离心管进行第2步操作。 2) 匀浆：组织样品按50-100mg/mlTrizol 加入Trizol，另外，组织体积不能超过Trizol体积 的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。 从细胞中提取总RNA 1) 培养贴壁细胞：不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按10cm2/ml比例加入。 2) 悬浮细胞可直接收集、裂解，每1ml Trizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞，或107细菌细胞。 2．细胞或组织加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保持。 3．12000rpm 离心5min，弃沉淀。 4．按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀15分钟，室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器， 以免基因组DNA断裂。 5．4℃12000g离心15min。 6．吸取上层水相，至另一离心管中。 注：1）千万不要吸取中间界面。 2)若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。 7．按0.5ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。 8．4℃ 12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。 9．按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。 10．4℃ 8000g离心5min，尽量弃上清。 11．室温晾干或真空干燥5-10min。 注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。 12．可用50ul H2O，TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品，55-60℃5-10min。 注：H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。 12、测O.D值定量DNA浓度。 注：1）此方法提取RNA A260/A280值在1.6-1.8之间。 2) 产率估计：组织标本：（ug RNA/mg组织）1-10ug，培养细胞（ug RNA/106 Cell）：5-15ug。 注：1、组织或细胞量过少，可酌情减少Trizol用量。 2、组织或细胞用量过多，会引起DNA对RNA的污染。 3、高蛋白，脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆或液氮研磨 后须4℃ 1200离心10min去掉不溶物，再进行下面操作，若顶层有脂肪物，则 也须去掉。 4、热天提RNA，带手套是必须的，手是RNase的主要来源。 5、组织块用