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细胞生物学综合性实验 课程名称: 细胞生物学实验 姓 名: 班 级: 学 号: 时 间: 年 月 日 植物原生质体的分离、纯化及融合 1 材料、试剂与方法 1.1 材料 菠菜叶片,唐古特白刺愈伤组织,金盏菊花瓣。 1.2 试剂 5%次氯酸钠,无菌水,酶液A,0.2mol/L的Cacl2.2H2O溶液,20%蔗糖溶液，0.16 mol/L的Cacl2.2H2O溶液，酶液B,12%蔗糖溶液，PEG溶液，高PH高钙稀释液。 1.3 方法 1.3.1 菠菜叶片和金盏菊花瓣的消毒处理 称取金盏菊花瓣1.5g或菠菜叶1g,用自来水冲洗;分别用5%次氯酸钠溶液浸泡10分钟，再用无菌水洗4次。 1.3.2 原生质体的分离 1.将消毒后的金盏菊花瓣用镊子撕成细丝。 2.酶解：加5ml酶液A,封口，保持28℃,3-6小时。 3.过滤及离心：600r/min离心5min,弃去上清液保留沉淀。 1.3.3 原生质体的纯化 1.将沉淀用2ml 0.2mol/L的Cacl2.2H2O溶液悬浮。 2.用注射器缓缓向离心管底部6ml 20%蔗糖溶液,600r/min离心5min,得到原生质带。 3.用注射器吸出管底杂质和蔗糖及上部Cacl2.2H2O溶液。 4.留下的原生质带用5ml 0.2mol/L的Cacl2.2H2O溶液悬浮, 600r/min离心5min。 5.用3ml 0.16mol/L的Cacl2.2H2O溶液悬浮。 1.3.4 原生质体的融合 1.将菠菜叶和金盏菊的原生质体悬液等量混合。 2.用吸管将混合的原生质体混合液滴在培养皿中，7-8滴每皿，静置10min,使其贴壁。 3.用吸管将等量的PEG溶液滴在原生质液滴上，静置10-15min观察细胞的粘连。 4.用刻度吸管向原生质液滴慢慢加入高PH高钙稀释液。第一次0.5ml,第二次1ml，第三四次各2ml,每次间隔5min。 5.平皿微倾斜，吸取上清液，缓缓加入4ml高PH高钙稀释液,静置5min后弃去上清液。 6.加入MS培养基4ml, 静置5min后弃去上清液。 7.每皿加入4mlMS培养基，摇匀。 1.3.5 原生质体的培养 封口，20℃培养 2 结果与分析 两细胞融合现通常分为五个阶段： ①两细胞膜接触，粘连；②细胞膜形成穿孔；③两细胞的细胞质连通；④通道扩大，两细胞连成一体；⑤细胞完全合并，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。 图1 图2 图1：离心后的原生质条带图—中间部分 图2：原生质融合图×10 3 讨 论 (1).所有在此实验中所使用的器材都要灭菌 (2).金盏菊花瓣一定要撕成很细的细丝，使之与酶A充分接触，使原生质体彻底分离 (3).在酶解的过程中每半个小时摇动小瓶使花瓣充分与酶A接触 (4).实验过程中移液管和胶头滴管不能混用，防止相互污染。 参考文献 [1] 郭晓华,那宁馨.新疆杨组织培养技术的研究[J].中国农学通报,2002,18(3):25-26. [2] 李向辉.植物遗传操作技术。科学出版社。1998。 177-184 [3] 孙勇儒，遗传学手册。湖南科学技术出版社，1989,447-448 [4]王金发，细胞生物学实验教程 [5]Scitz HU.Scitz U. AlfemannW. Pflanzliche GewebeKultnr. Ein PrnKtiKnrn Stuttgnrt, New York, 1986, 21-28