无能T淋巴细胞的建立及其文档..doc

无能T 淋巴细胞的建立及其免疫生物学特性的研究 =摘要 目的 探讨体外诱导 T 淋巴细胞无能的条件, 并分析无能 T 淋巴细胞的免疫生物学特性。方法 以 Wi star大鼠的脾细胞为刺激细胞, SD大鼠的脾细胞为反应细胞,进行混合淋巴细胞反应( MLR) ,分别单独或联合加入剂量不等的抗 B7 21 单克隆抗体(抗B7 21 单抗)、 抗 B7 22 单克隆抗体(抗B7 22单抗) , 制备无能 T 淋巴细胞。将无能 T 淋巴细胞和刺激细胞混合,分别加入抗 CD3 单克隆抗体、刀豆蛋白(Con A)及白细胞介2( IL22) , 分析各种情况下无能 T 淋巴细胞的增殖情况; 将刺激细胞与同种异体 SD大鼠脾细胞混合, 分别加入不同数量的无能 T 淋巴细胞, 分析 SD大鼠淋巴细胞的增殖情况。结果 单独应用抗 B7 21单抗或抗 B7 22 单抗, 对淋巴细胞增殖的抑制作用不明显,而将二者联用,能明显阻断 T 淋巴细胞增殖; Co n A及 IL 22 能使无能 T 淋巴细胞增殖, 而抗 CD3 单克隆抗体不能使无能 T淋巴细胞发生增殖;无能 T 淋巴细胞对同种异体 T 淋巴细胞的增殖也产生抑制作用, 该效应具有抗原特异性。结论 联合抗 B7 21 单抗和抗 B7 22单抗可诱导 T 淋巴细胞无能; 无能 T 淋巴细胞在体外呈免疫无反应性,并能抑制同种异体 T 淋巴细胞的增殖,该抑制作用具有抗原特异性。 =关键词 免疫耐受;抗体, 单克隆;表位; T 淋巴细胞; 淋巴细胞培养试验,混合 T 淋巴细胞是介导排斥反应的主要淋巴细胞[ 1], 它的激活、 分化和增殖在免疫应答中起关键作用,因此,诱导抗原特异性 T 淋巴细胞的长期无反应状态具有重要意义。T 淋巴细胞无能是 T 淋巴细胞产生免疫耐受的主要机制之一[2], 无能是指T 淋巴细胞的功能性无反应或失活, 而不伴有细胞死亡[3]。我们联用抗B7 21 单克隆抗体(抗B7 21 单抗)和抗B722 单克隆抗体(抗 B722 单抗)阻断B7/CD28共刺激途径,在体外诱导 T 淋巴细胞无能, 并分析其体外免疫生物学特性, 从细胞水平上探讨无能T 淋巴细胞诱导免疫耐受的作用机制,以期建立持续、 稳定的移植耐受状态。 材料和方法 一、 材料 1. 动物: Wistar 大鼠及 SD 大鼠, 鼠龄 8~ 10周,雄性, 体重150~ 180 g, 由中山大学实验动物中心提供。以Wistar大鼠的脾细胞作为刺激细胞, SD大鼠的脾细胞作为反应细胞。 2. 主要试剂: 纯化的功能阻断性小鼠抗大鼠B721(CD80)单克隆抗体、 抗 B7 22( CD86)单克隆抗体和小鼠抗大鼠CD3 单克隆抗体(抗CD3 单抗)均为BD生物科学公司产品; 促有丝分裂原刀豆蛋白A( Con A)、 丝裂霉素C(MMC)及大鼠重组白细胞介素2( IL22)均为Sigma公司产品;红细胞溶解试剂盒购自RD systems 公司;细胞增殖分析试剂盒购自Chemicon 国际公司;淋巴细胞分离液(密度1. 077g/ cm3)由上海恒信化学试剂有限公司生产。 二、 方法 1. 大鼠脾细胞悬液的制备: 参见文献[ 4]。收集脾细胞后,用红细胞溶解试剂盒去除红细胞,调整脾细胞浓度为( 0. 5~ 1. 0) @107/ ml。 2. Wistar大鼠刺激细胞的制备:参见文献[ 5]。 3. 抗B7 21 单抗和抗B7 22 单抗对T 淋巴细胞增殖的影响: 将刺激细胞和反应细胞(均为 4 @105个/孔)加入 96 孔板混合, 200 Ll/孔,按所加抗体的不同分为4 组: ( 1)抗B7 21 单抗组,各孔分别加入不等量的抗 B721 单抗, 使其终浓度分别为0. 001、0. 01、 0. 1、 1、 10 Lg/ ml; ( 2)抗B7 22 单抗组, 各孔加入不等量的抗 B722 单抗,其终浓度同抗B7 21 单抗 组; ( 3)抗B721 单抗与抗 B722 单抗联用组, 各孔按上述终浓度加入两种单抗; ( 4)不加单抗组, 为对照组。以上每种条件设 3 个复孔,均在37 e 、 含体积分数为 5 % CO2 的培养箱中孵育3 d 后,用细胞增殖分析试剂盒分析反应细胞的增殖情况(以其在 480 nm 波长下的吸光度 A 值表示,下同)。 4. 无能T 淋巴细胞的制备: 将刺激细胞与反应细胞(均为4@106个/孔)加入12 孔板中混合, 用完全RPMI 1640 液重悬成3 ml/孔,再加入抗B721 单抗和抗B722 单抗各30 Lg(终浓度均为 10 Lg/ ml) ,在37 e 、 含体积分数为5 % CO2的条件下培养5 d后,收集细胞,再用完全RPMI 1640 液培养 2 d,