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哺乳动物胚胎切割技术研究及应用进展 哺乳动物胚胎切割技术研究及应用进展 胚胎切割是哺乳动物胚胎工程的重要组成内容，是应用显微手术的方法，将一枚胚胎分割成二分、四分甚至八分胚，经体内或者体外培养，然后移植入受体中，获得同卵双生或同卵多生后代的技术。胚胎分割是扩大胚胎数量的有效方法，也是胚胎克隆技术的一种，其不仅增加了优秀个体数量，而且还可将同卵双生后代用于各种试验研究，能排除遗传特性差异所带来的影响，在科学研究和畜牧生产中具有重要的意义。 　　1 哺乳动物胚胎切割技术的研究进展 　　1901年Spemann首次将蛙的两个卵裂球分离开，人工产生了双胞胎。1970年Mullen等将小鼠2-细胞胚胎的两个卵裂球分开，经过体外培养后再移植给受体，产生了哺乳动物的首次人工双胞胎。197Moustafa等将小鼠桑椹胚一分为二，得到双胞胎。1979年Willadsen[1]和MEineck-Tillmann等分别将绵羊2-细胞胚胎和桑椹胚一分为二，获得同卵双胞胚。80年代以来，哺乳动物胚胎分割技术飞速发展。Willadsen[2]等在总结前人的基础上，对胚胎分割进行了系统的研究，创造出了毛细管分离法，并先后分离2、4、8细胞绵羊胚胎，获得后代羔羊。毛细管分离法虽然具有较高的同卵多生的优点，但需要琼脂包埋和中间体的体内培养，很难做到与受体同期化，且操作复杂。1982年，Ozil等[3]把分割后的牛的半胚分别装入空透明带内，移植获得同卵后代。后来，Gatica等简化的操作方法，将细胞团从切开的透明带中取出，用玻璃针一分为二，再将半胚分别移入空透明带中直接移植，获得了7只双胎。1984年，Williams等[4]用显微手术刀分割牛桑椹胚和早期囊胚，获得9头双胎犊牛。 　　后来，胚胎切割和性别鉴定技术结合起来，以及嵌合体的应用，为胚胎切割技术扩大了应用和推广的范围。 　　我国胚胎切割技术的发展与应用20世纪80年代发展迅速。1988年，谭丽玲[5]等分割兔半胚产仔，1989年张涌等[6]山羊冻胚分割产羔，90年代前后分割牛羊成功，郭志勤等于1989年获得奶牛冻胚分割植后产同卵双犊和1992年绵羊鲜胚分割四分胚移植产同卵羔[7-8]；1989年牛四分胚成功产犊。 　　通过胚胎分割技术还可获得性别和遗传上完全相同的同卵孪生或多生后代，为遗传学、生理学、营养学等研究提供宝贵试验材料。目前二分胚成功的有小鼠、兔、绵羊、山羊、牛、马和人。四分胚成功的有兔、绵羊、猪、牛、马，八分胚成功的有兔、绵羊、猪。 　　胚胎切割方法 　　 微细管吹吸法 　　借助显微操作仪，在D-PBS培养液中，左手持固定吸管吸住胚胎，右手操作玻璃微针切开胚胎透明带，细胞团即从透明带中脱出，用毛细管吹吸胚胎，得到单个卵裂球，再将其装入空透明带中，体外培养至桑椹胚或囊胚期，移植入同类受体中。此方法适于分离二细胞期到八细胞期卵裂球。 　　2.显微手术法 　　在显微操作仪的帮助下，在D-PBS液内，用固定吸管吸住胚胎，用玻璃针或显微手术刀将胚胎对称切割。这种方法适于分割桑椹胚和囊胚期胚胎。 　　2.徒手分割法 　　在立体显微镜下，徒手握住特制切割刀，在皿底部轻轻划痕，然后将胚胎轻轻推入划痕处，通过增大摩擦力来固定住胚胎，将刀片自上而下垂直切割胚胎，操作过程要快，一刀切开。这种方法多用于切割桑椹胚和囊胚。 　　影响切割胚成活效果的因素 　　 胚胎发育时期 　　不同发育时期的胚胎分割后，其发育能力是有差异的。1984年，Williams 等[4]用显微手术刀分割～日龄牛胚胎，晚期桑椹胚、早期囊胚和囊胚的半胚移植妊娠率分别为%、%和%。1989年，张涌等[6]分别利用不同发育时期的羊半胚切割移植，结果晚期桑椹胚、囊胚、孵出囊胚和孵出增大胚泡各组半胚生产羔羊的成功率分别为%、20%、25%、%。1995年，马宝华[8]报道，安哥拉山羊早期囊胚、囊胚和扩张囊胚的半胚移植后成羔率分别为%、%和%。由以上报道可以看出囊胚半胚的成犊率高于来自于桑椹胚的半胚。 　　3.胚胎切割次数 　　四分胚的成活力、妊娠率、双胎率都远低于二分胚。1992年窦忠英[9]等将18枚7日龄奶牛胚胎一分为四分割的半胚移植给受体，只有9头受孕 ，受孕率为50%。Rho等[10] 发现四分牛的桑椹胚和囊胚只得到一个四分胚后代。 　　3.透明带的完整性 　　透明带可以阻止微生物和病毒进入胚胎内部，对胚胎具有一定的保护作用。但桑椹胚和囊胚时期，半胚有无透明带对妊娠率没有太大影响。1995年，马保华等[8]用链霉蛋白酶液软化透明带后分割胚胎，试验结果发现可降低半胚存活率。Sotomaru等[11]曾发现，有透明带的分割胚比无透明带的分割胚对冻融有更高的抵抗力。2000年赖双英[12]等用