新·猪肺炎支原体生长培养基的筛选-精.docVIP

猪肺炎支原体生长培养基的筛选 李石，李劼*，周霞* (新疆石河子大学动物科技学院，石河子市　832003) 摘要：为了解猪肺炎支原体的培养特性，筛选出肺炎支原体生长的最适培养基，本实验采用颜色改变单位（CCU)法和PCR方法对猪肺炎支原体在四种常用培养基及改良KM2培养基中生长情况进行了检测与比较。结果显示：本实验室改良KM2培养基为最适培养基，10天时颜色改变单位可达108CCU/mL。 关键词：猪肺炎支原体；培养基；筛选 The screening of Mycoplasma hyopneumoniae growth medium Li Shi,Li Jie*,Zhou Xia* (College of animal science and technology of shihezi university,Shihezi 832003,China) Abstract: In order to develop the culture characteristics of Mycoplasma hyopneumoniae, pick out the most suitable medium, the color change unit (CCU) method and PCR method was used to test and compare the culture of swine mycoplasmal pneumonia cell number between four kinds of medium and improved KM2 medium. The results showed that: the improved KM2 medium was the optimum medium, the color change unit is 108CCU/ml after 10 days of culture. Key words: Mycoplasma hyopneymoniae; medium; screening 猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneymoniae,Mhp）是引起猪支原体肺炎（MPS，又称“喘气病”）的主要病原。 猪肺炎支原体是一种微小的原核生物，无细胞壁，可在人工培养基上生长，形成呈点状露珠样菌落。但是由于生长速度慢，培养条件苛刻而难以培养[1], 常因猪鼻支原体的过度生长而被掩盖[2]。猪肺炎支原体的培养被认为是该病原体检测的黄金标准[3]。 本实验将猪肺炎支原体168株和强毒济南株分别接种于Goodwin等复合培养基、驴血清培养基、A26培养基、KM2培养基以及改良KM2培养基中进行了培养试验，采用颜色改变单位（CCU)计数法和PCR方法对猪肺炎支原体在5种培养基中的生长繁殖情况进行了检测与比较，以期筛选出Mhp生长最适培养基，为快速、有效地诊断猪支原体肺炎提供参考依据。 1材料及方法 1.1材料 1.1.1实验菌株 猪肺炎支原体168株，从南京天邦生物科技有限公司生产的猪支原体肺炎克隆弱毒活疫苗(支必宁)中分离。 猪肺炎支原体强毒济南株，由新疆畜牧科学院兽医研究所惠赠。 1.1.2培养基 Goodwin等氏复合培养基(简称GW培养基)、A26肉汤培养基(简称A26培养基)和驴血清培养基参考文献[4]配制；KM2培养基购于江苏农科院兽医所；改良KM2培养基由本实验室自己配制(1L：10g/L水解乳蛋白Hanks液400mL；DMEM400mL；无菌猪血清200mL；酵母浸液10mL；青霉素200IU/mL；酚红4g/L；pH调至7.6）。 1.1.3试剂及仪器 10×Buffer、25 mmol/L MgCl2、2.5 mmol/L dNTPs、2.5UTaq酶(北京诺维森生物科技有限公司)；Marker1、Loding Buffer(广东东盛生物科技有限公司)；PCR仪（TC-512)，电泳仪等。 1.2方法 1.2.1菌株分离与复苏 将冻存的支必宁和强毒济南株，在无菌条件下，分别用3mL灭菌水稀释，按10%的比例分别接入到5种液体培养基中进行菌株分离与复苏培养，每7天传代1次，共传2～3代。 1.2.2颜色改变单位(CCU)计数 将5种液体培养基分别分装于无菌试管中，每管2.7mL，于第一管加入菌液0.3mL，混匀后吸取0.3mL至第二管，依次类推做10倍梯度稀释直到10-8，从最后一管中吸取0.3mL废弃，设各液体培养基做空白对照，每种培养基做两个平行组。于37℃恒温箱培养，每天观察各培养基的颜色变化，以培养基颜色改变的最末一管作为培养菌液的CCU。? 1.2.3 PCR方法检测 参考文献[5]合成1对Mhp l