新·医学基础化学 可见分光光度法和紫外分光光度法.pptVIP

第十三章 可见分光光度法和紫外分光光度法 Visible Spectrophotometry and Ultraviolet Spectrophotometry 第一节 物质的吸收光谱 一、物质对光的选择性吸收 光照射某物质，物质能够吸收光，使原有的基态转为激发态，只有当分子的能量(h?)与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差(?E)相等时才能被吸收。 M(基态)+ h? ??M*(激发态) 物质对光的吸收具有选择性，若溶液选择性地吸收了某种颜色的光，则溶液呈吸收光的互补光。 第一节 物质的吸收光谱 第一节 物质的吸收光谱 二、物质的吸收光谱 将不同波长的单色光依次通过有色溶液，测量溶液的吸光度A(absorbance)。 以波长?为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，得吸收曲线，或称吸收光谱。 吸收光谱中，吸光度最大处的波长为最大吸收波长，用?max表示。 一般，?max是定性鉴别物质的基础 。 不同浓度的溶液，?max不变，浓度与峰值成正比，这是进行定量分析的依据。 第一节 物质的吸收光谱 三(邻二氮菲)合铁(II)离子的吸收光谱图(absorptionspectrum) ?max=510nm 不同浓度的溶液，?max不变，浓度与峰值成正比。 第二节 分光光度法基本原理 一、透光率 (transmittance)和 吸光度(absorbance) 入射光强度I0，吸收光强度Ia，透过光强度It， 反射光强度为Ir I0 ═ Ia + It + Ir 被测溶液和参比溶液的吸收池同样材料和厚度，反射光强度影响相互抵消，上式简化为 I0 ═ Ia + It 第二节 分光光度法基本原理 一、透光率和吸光度 透射光的强度It与入射光强度I0之比称为透光率(transmittance)，用T表示 透光率的负对数称为吸光度，用符号A表示。A愈大，溶液对光的吸收愈多。 第二节 分光光度法基本原理 二、Lambert—Beer定律 Lambert- Beer定律： A =?bc 溶液厚度b，单位cm；浓度c，单位mol?L-1； 摩尔吸光系数?(molar absorptivity ) 单位:L?mol -1?cm-1 若用质量浓度?代替c A ═ ab? 质量吸光系数(apercentange absorptivity) 单位:L?g -1?cm-1 a和?可通过下式相互换算 ? ═ aM 第二节 分光光度法基本原理 透光率T与溶液浓度c (或液层厚度b)之间的关系也可以以指数函数关系来表示： - lgT ═ ?bc T ═ 10-?bc 第二节 分光光度法基本原理 应用Lambert—Beer定律时，需注意以下几点： Lambert—Beer定律仅适用于单一波长的单色光。入射光的波长范围越宽，则测定结果越容易偏离Lambert—Beer定律。 吸收过程中各物质间无相互作用，但各物质的吸光度具有加和性。即 A ═ Aa+ Ab + Ac + ?? 入射光波长不同时，摩尔吸光系数也不同。摩尔吸光系数越大，溶液对入射光的吸收就越强，测定的灵敏度就越高。 分光光度法仅适用于微量组分的测定。?(或a)确定是在低浓度下测定吸光度A，通过计算求出。 第二节 分光光度法基本原理 例13-1 已知某化合物的相对分子质量为251，将此化合物用乙醇作溶剂配成浓度为0.150mmol?L-1的溶液，在480nm波长处用2.00cm吸收池测得透光率为39.8%，求该化合物在上述条件下的摩尔吸光系数?及质量吸光系数a。 第二节 分光光度法基本原理 解 由Lambert—Beer定律可得 已知 c ═ 0.150?10-3mol?L-1，b ═ 2.00cm， T ═ 0.398 代入 第二节 分光光度法基本原理 例 测试酶与腺苷酸(AMP)体系的吸光度 如下：A(280nm) ═ 0.46， A(260nm) ═ 0.58 试计算每一组分的浓度。 已知：酶的?(280nm) ═ 2.96?104L?mol-1?cm-1 ?(260nm) ═ 1.52?104L?mol-1?cm-1 AMP的?(280nm) ═ 2.4?103L?mol-1?cm-1 ?(260nm) ═ 1.5?104L?mol-1?cm-1 吸收池厚度为1.00cm。 第二节 分光光度法基本原理 解 设酶和AMP的浓度分别为y和z 因吸收光的加和性 ?为260nm 0.58 ═ 1.52?104?1.00 ?