木聚糖酶檢测方法.docVIP

木聚糖酶活力的测定 分光光度法 1 原理 木聚糖酶能将底物木聚糖（本实验采用Xylan from oat spelt，燕麦木聚糖，Sigma NO. :X0627）降解成寡糖和单糖，具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算待测木聚糖酶的活力。 2 木聚糖酶活力单位（U）的定义 在40℃、pH值为5.0的条件下，1.0 min从浓度为5 mg/mL的木聚糖溶液中降解释放1 μmol还原糖（以木糖表示）所需要的酶量为一个酶活力单位（U）。其中样品的酶活力以 U / g（固体酶）或U / mL（液体酶）表示。 桦木木聚糖（Xylan from birch wood）山毛榉木聚糖（Xylan from beechwood） 3 主要仪器 3.1 分光光度计 3.2 精密电子天平 精确至0.0001 g。 3.3 恒温水浴锅 30-60℃可调，精度为0.1℃。 3.4 酸度计 精确至0.01。 3.5 秒表 每小时误差不超过5s。 3.6 刻度试管（15mL） 带玻璃塞，10支以上。 3.7 移液管（0.5、1、2、5、10mL） 3.8 分样筛 孔径为0.25 mm（60目）。 3.9 分析天平 精确至0.001 g。 3.10 磁力搅拌器 附加热功能。 3.11 电磁振荡器 3.12 烧结玻璃过滤器 孔径为0.45 μm。 3.13 离心机 3000 r/min 3.14 冰箱 4 试剂与溶液配制 除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的二级水。 4.1 氢氧化钠（NaOH）溶液（浓度为200 g/L） 称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容至100mL。 4.2 乙酸（CH3COOH）溶液（浓度为0.1 mol/L） 吸取冰乙酸0.60mL，加水溶解，定容至100mL。 4.3 乙酸钠溶液（CH3COONa）（浓度为0.1 mol/L） 称取三水乙酸钠1.36g，加水溶解，定容至100mL。 4.4 乙酸——乙酸钠（CH3COOH — CH3COONa）缓冲溶液（浓度为0.1 mol/L，pH为5.0） 称取三水乙酸钠19.17 g，加入冰乙酸3.60 mL。再加水溶解，定容至2000 mL。测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.0，再用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调节至5.0。用精密pH试纸检定。 4.5 木糖（C5H10O5）溶液（浓度为10.0 mg/mL） 称取无水木糖1.000 g，加乙酸——乙酸钠缓冲溶液（4.4）溶解，定容至100 mL。 4.6 木聚糖溶液（浓度为10.0g/L） 称取木聚糖（Sigma X0627）1.00 g，加入0.32g氢氧化钠，再加入90 mL水，磁力搅拌，同时缓慢加热，直至木聚糖完全溶解。然后停止加热，继续搅拌30 min，加入0.8 mL冰乙酸。继续磁力搅拌，测定其pH值。如果pH值为5.0，用乙酸——乙酸钠缓冲溶液（4.4）定容至100 mL。如果pH值偏离5.0，再用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调节至5.0，然后再用乙酸——乙酸钠缓冲溶液（4.4）定容至100 mL。木聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4℃避光保存，有效期为3天。 4.7 DNS试剂 称取3,5-二硝基水杨酸3.15 g（化学纯），加水500 mL，搅拌5 s，水浴至45℃。然后逐步加入100 mL氢氧化钠溶液（4.1），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃。）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0 g、苯酚2.50 g和无水亚硫酸钠2.50 g。继续45℃水浴加热，同时补加水300 mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为6个月。 4.8 乙酸——乙酸钠2号缓冲溶液 量取100mL乙酸——乙酸钠1号缓冲溶液，加入0.15gTriton X-100（曲拉通100），0.15g牛血清白蛋白（BSA）混合均匀。如果pH值偏离5.0，再用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调节至5.0。 5 标准曲线的绘制 吸取乙酸——乙酸钠缓冲溶液（4.4）2.0 mL，加入DNS试剂（4.7）3.0 mL，沸水浴加热5 min。用自来水冷却至室温，用水定容至15.0 mL，制成标准空白样。 分别吸取木糖溶液（4.5）3.00、4.00、5.00、6.00 7.00和8.00mL，分别用缓冲溶液（4.4）定容至1