植物RNA的快速提取..docVIP

RNA提取（TRIZOL法） 一、原理 TRIzol是一种快捷方便的总RNA提取试剂，可以从动物组织、各种微生物及细胞等中提取总RNA。在样品处理过程中，TRIzol可完全充分裂解样品，同时保持RNA的完整性。加入氯仿离心后，溶液形成上清层（水相）、中间层和有机相（下层）。取出上清层，可用异丙醇沉淀回收RNA；中间层用乙醇沉淀回收DNA；有机相可用异丙醇沉淀回收蛋白。TRIzol试剂可用于少量样品的RNA提取，也可用于大量样品的RNA提取。提取RNA 整个过程方便快速，整个操作过程可一个小时内完成，提取的RNA无蛋白和DNA的污染，纯度髙，可直接用于Northern Blotting、斑点杂交、polyA筛选、mRNA纯化、体外翻译、RNase保护分析、RT-PCR、构建cDNA文库等各种分子生物学实验。 二　操作步骤 RNA提取过程的关键是建立一个无RNase的实验环境，因此在整个操作过程中要防止RNase的污染，应注意以下几点： 1.实验过程中经常更换新手套，使用专用超净台，在操作过程中避免讲话； 　　　　　　　　　　　　　　　　　2.应尽量使用无RNase的实验器材；枪头、塑料制品和玻璃制品可以用0.1％DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理过夜，然后　　　　在120℃下高压灭菌30min以去除残留的DEPC。玻璃制品也可用干热灭菌去除RNase（180℃烘烤2h）； 　　　　　　　　　　　　3.配制溶液应使用无RNase水（无RNase水的配制方法：双蒸水加入DEPC至终浓度0.01％ V/V，放置过夜，然后120℃下高压灭　　　　　菌30min，备用）； 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　4.　整个实验过程中使用的试剂，实验器材和无RNase水应专用，避免交叉污染。 　用户自备试剂：氯仿、异丙醇、75％乙醇（用DEPC处理过的水配制）、无RNase的无菌水。样品处理 A　 贴壁培养细胞 　　　 ①　 倒净培养液； 　　　 ②　 每10cm2生长的培养细胞中加入1mL硕盟TRIzol试剂，在室温下水平放置5min，使裂解液均匀分布于细胞表面，然后用移液枪　　　　　吹打细胞使细胞脱落； 　　 ③　 将细胞裂解液转移至离心管中，并用1mL枪头反复吹打直至裂解液中无明显沉淀，在室温下放置5min，使得核酸蛋白复合　　　　　　　物完全分离； B　 悬浮培养细胞 ①　直接离心收集细胞，倒净培养液； ②　细胞沉淀中每5～10×106细胞加入1mL硕盟TRIzol试剂； ③　将细胞裂解液转移至离心管中，并用1ml枪头反复吹打直至裂解液中无明显沉淀，在室温下放　 置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离； C　 动、植物组织材料 　　①　将组织在液氮中磨碎成粉末状（应无明显颗粒）； 　 ②　每50～100mg的组织加1mL硕盟TRIzol试剂，样品的体积不应超过TRIzol试剂体积的10％，并用匀浆器进行匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状； 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　③　将细胞裂解液转移至离心管中，在室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离； 　④　12,000g， 4℃离心10min，然后小心吸取上清液，移入新的离心管中； 2．　　 向上述步骤1得到的裂解液中加入氯仿（每使用1mL硕盟TRIzol加0.2mL氯仿），盖紧离心管管盖，用手上下振荡15s（请勿涡漩激烈振荡），得粉红色浑浊液，无分层现象，室温静置3min； 3．　　 12,000g，4℃离心15min； 4．　　 取出离心管，样品分为三层：无色的上清水相、中间的白色层及粉红色的下层有机相。小心吸取无色上清水相移至另一离心管，水相的体积约为所用硕盟TRIzol试剂的60％； 5．　　 向步骤4得到的上清水相加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min； 6．　　 12,000g，4℃离心10min； 7．　　 小心去除上清，缓慢沿管壁加入1mL75％的乙醇（用DEPC处理过的水配制），轻轻混匀。每使用1mL硕盟TRIzol试剂至少加1mL 75％的乙醇； 8．　　 12,000g，4℃离心10min； 9．　　 小心吸尽上清； 10．室温干燥沉淀2～5min（不可晾得太干，否则RNA将会很难溶解），加入30～50μL的无RNase水溶解RNA沉淀，待完全溶解后于-70℃保存。取RNA样品用1×TE Buffer（见备注）稀释样品100倍或适当的倍数，测定样品在260nm和280 nm的吸收值确定RNA的质量。 RNA的浓度＝OD260×稀释倍数×0.04μg/μL，OD260/280 在1.8～2.1视为抽提的RNA的纯度很高。 　 四、注意事项 本试剂含强变性剂