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荧光定量PCR原理及操作规范 5’ 5’ 3’ 3’ d.NTPs Taq酶 Primers 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 反应体系 变 性 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Taq l 5’ 3’ R Q Probe 5’ 3’ R Q 荧光定量PCR原理 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ R Q 退 火 5’ 3’ 1. 链取代 Taq 3’ Q R 5’ 5’ 3’ 3’ Q Taq R 5’ 2. 水 解 3. 聚 合 5’ 3’ Q Taq R 3’ 5’ 4. 检测荧光 5’ 3’ 3’ Q Taq R 5’ l 什么是荧光定量PCR？ 荧光定量PCR是指在PCR反应体系中引入荧光基团，利用荧光信号的变化实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线和CT值对未知模板进行定量分析的方法。 荧光PCR的化学原理 定量PCR的数学原理 荧光PCR信号方程 Threshold（阈值） CT CT值： C代表Cycle，T代表阈值(threshold)，CT值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 CT值由阈值确定 荧光PCR的光学原理 定量PCR仪日常维护 PCR实验室的规范化设置 试剂准备间 功能： 贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。 注意事项： 含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。 戴手套。 工作结束后必须立即对工作区进行清洁。 实验室及其设备的使用必须有日常记录。 样本处理间 功能： 临床标本的保存，核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。 注意事项： 正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。 为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。 对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。 用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器内。 用于RNA扩增检测的样本制备好以后，应立即进行cDNA合成。 扩增间 功能： DNA或cDNA扩增。 注意事项： 已制备的DNA模板和合成的cDNA的加入和主反应混合液制备成反应混合液等也可在本区内进行。 在巢式PCR测定中，第二次加样必须在本区内进行。 可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。 如有加样则应在超净台内进行。 打开反应管前快速离心数秒。 PCR实验室污染及对策 污染源 1.标本间的交叉污染。 2.实验室中克隆质粒的污染。 3.PCR产物的污染。 PCR实验室污染及对策 污染处理方法 1.通风 2.次氯酸钠 3.紫外照射 课后思考：紫外照射消除污染的原理？ * 质管部培训资料 质管部培训资料 质管部培训资料 * 质管部培训资料