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常见猪病PCR检测操作步骤及试剂配制 RNA病毒（蓝耳病、猪瘟、乙脑、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、轮状病毒等） 包括病料的处理、RNA的提取、反转录、和PCR扩增、凝胶电泳四个步骤。 病料的处理 取组织病料约2克，加入4-5毫升灭菌的PBS或者生理盐水，置研磨器（灭菌）中研磨或者用剪刀细心剪碎，置-20℃中反复冻融三次，即可用于检测。 RNA的提取 取上述冻融三次的病料约200微升置1.5毫升的离心管中，加入500-600微升TRIzol剧烈振摇30秒后，静置5分钟后，再次剧烈振摇30秒后，静置5分钟。 在加入200微升的氯仿，上下颠倒混匀30s，静置5分钟，4℃ 12000g离心15 min。 离心完毕后，取上清约400-500微升（注意不要吸到中间层白色物质）置新的灭菌好的离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒数次后（不可剧烈震动）静置10分钟，4℃ 12000g离心10 min.可见管底部有少量白色沉淀，倒掉异丙醇，加入1毫升75％的乙醇（DEPC水配制），振摇，将白色沉淀悬浮，4℃ 7500g离心5 min。弃去上清，干燥沉淀物（将离心管倒置于卫生纸或者其它吸水纸上，室温约5 min即可）加入20μLDEPC水溶解用于或于-20℃保存备用。 在10μL的反转录体系中加入： RNA7μL、5×Buffer 2μL、10 mM dNTP 0.25μL、OligodT)18 0.5μL或者下游引物0.5μL；M-MLV 100U/μL 0.25μL（反转录酶） 37℃水浴1h,立即用于PCR扩增或置于- 20 ℃保存备用。 反应体系25μL cDNA 2μL，（模板） 25mmol/L Mg2+ 1.5μL， 2.5mmol/L dNTPs 2.0μL， 10× Mg2+ free PCR Buffer 2.5μL， 20mmol/ L上下游引物各1μL， Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL 无菌双蒸水补至25.0μL。94℃预变性3 min；94℃ 45s，56℃ 45s，72℃ 45s，共进行36个循环；最后72℃延伸10min。（根据不同的病毒设定时间和温度） 一步法：采用的是TaKaRa 的PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒 在25uL反应总体系： 1 PrimeScript 1 Step Enzyme Mix , 1uL 2 2 × 1 Step Buffer ， 12.5uL 3 RNase Free dH2O ,6.5ul 4 20mmol/ L上下游引物各1μL， 5 提取的RNA模板：3ul 反应条件：50℃反转录30min，94℃预变性2min，进行30个循环（94℃变性1min，56℃退火1min,72℃延伸1min）72℃延伸10min。扩增完的PCR产物放4℃保存。 凝胶电泳 1%琼脂糖凝胶的配制 0.25琼脂糖+25毫升TAE+1.25微升Goidview放入锥形瓶中，置烤箱中约1分钟沸腾后，摇匀，放置室外，约20-30分钟后倒入板中，约30-45分钟凝固后即可使用。 点样：将凝胶放入电泳槽中，DL2000的DNA Marker3-5微升，其它样品5微升+0.5-1微升的londingbuffer混合后点样，开启电泳仪，电压80-150VμL PCR产物与4μL 6×Loading Buffer混匀，1%琼脂糖凝胶（0.5ug/ml）μL回收产物点样观察回收效果。 纯化： () 称量胶块重量，计算胶块体积，按照1mg等于1μL计算胶块体积； () 向胶块中加入3倍胶块体积的融化液DR-I Buffer； () 均匀混合后65水浴10 min，其间摇晃3-5次使胶块完全溶化； () 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer 0.5倍体积量的DR-II Buffer，均匀混合； () 转移液体至Spin column中，12,000 rpm 离心1min，弃滤液（可将滤出液体回收再离心一次以提高DNA回收率）； () 将500ul 的RinseA加入Spin column 中，12,000 rpm 离心30s，弃滤液； () 将700 ul 的Rinse B加入Spin column 中，静置2－3 min，12,000 rpm 离心30s，弃滤液； () 重复上一步操作； () 10,000 rpm，离心1min，弃滤液； (1) 将Spin column 安置于一灭菌的1.5ml Eppendorf管中，在滤膜中央处加入灭菌双蒸水，室温静置1－2 min； (1) 12,000 rpm 离心1min，收集出液体再离心洗脱一次，即得到纯化的PCR产物。 12000 rpm/min离心五分钟，取上清液（500μl）