复方丹参滴丸对培养的乳鼠心肌细胞缺氢及-天士力集团.docVIP

中国病理生理杂志.2003，19（4）：409-502 复方丹参滴丸对培养的乳鼠心肌细胞缺氧及缺氧／复氧时Fos／FosIJ蛋白表达的影响 徐曼1， 李全凤1， 张伟华1， 张淑芹1， 徐长庆2， 王孝铭2 (哈尔滨医科大学1病理生理学教研室，2动物学部，黑龙江哈尔滨150006) 摘要：探讨复方丹参滴丸(Dan Shen Pill,DSP)对培养的乳鼠心肌细胞缺氧及缺氧／复氧时凋亡相关基因Fas／FasL蛋白表达的影响。方法：按常规培养新生4d乳鼠心肌细胞，于培养24h后进行缺氧及缺氧／复氧实验，以免疫组织化学方法检测心肌细胞Fas／FasL蛋白表达的变化。结果：缺氧4.5h及10.5h后，心肌细胞Fas／FasL蛋白的阳性表达指数(positive expression index，PEI%)均显著高于对照。10.5h组与4.5h组无明显差异。复方丹参滴丸组PEI明显低于缺氧组(P0.05)。缺氧30min后再给氧4h与10h，心肌细胞Fas／FasL蛋白的PEI显著高于对照，复氧10h组与4h组无明显差异，复方丹参滴丸组PEI低于缺氧复氧组(P0.05)。结论：缺氧及缺氧／复氧时均有凋亡相关基因FM及其配体FasL蛋白表达的增强，复方丹参滴丸可通过下调Fas／FasL蛋白表达以减少凋亡从而减轻缺氧损伤及缺氧／复氧损伤。 关键词：低氧；Fas／FasL蛋白；丹参滴丸；心肌 中图分类号：R363 文献标识码：A 细胞凋亡是多细胞生物体内的一个重要生命现象，无论在个体发育或在成体正常生理或疾病过程中均可发生，并且在体外培养物中也可出现。心肌缺血时，心肌细胞既有缺血性坏死，又有细胞凋亡。实验表明在缺血早期，心肌细胞凋亡占优势，晚期以心肌细胞坏死占优势[1]。心肌缺血再灌注所致的心肌细胞死亡以往多认为是细胞坏死，近来研究提示尚有心肌细胞凋亡。细胞凋亡的发生受多种基因表达的调控，其中Fas基因表达变化与凋亡的关系倍受关注[2]。丹参有广泛的抗凝血，抗氧化，钙拮抗保护缺血缺氧心肌细胞的作用[3]，本实验拟探讨复方丹参滴丸对培养的乳鼠心肌细胞缺氧及缺氧／复氧时凋亡相关基因Fas／FasL蛋白表达的影响。 材料和方法 1 主要试剂 1．1 RPMI—1640培养基，美国Gibco公司产品。 1．2 胎牛血清(FCS)，中国医科院血液病研究所。 1．3 胰蛋白酶Difco进口分装。 1．4 Fas／FasL抗体，IgG，武汉博士德生物工程有限公司提供。 1．5 复方丹参滴丸(Dan Shen Pill，DSP)天津天士力集团制药有限公司提供。 2 细胞培养 新生4d乳鼠24只，分两次进行细胞培养，每次12只，取出心脏，Hanks液冲洗3次，剪碎，0.125%胰蛋白酶消化分离，自然沉淀，弃上清，消化分离沉淀。分离后，上清加等量无血清培养基，离心10min，弃上清，沉淀加4~8mL培养基重悬，离心，重复2次，用含FCS的培养基将沉淀混匀；沉淀重复以上过程，直至组织块完全消化为止，共制成24瓶细胞悬液。培养瓶中预先放入1cm2盖玻片10个。培养24h后供实验用。 3 实验分组 通人氮气以制备缺氧，复氧时通入95%氧气-5%二氧化碳。实验分8组(1)缺氧4.5h组；(2)缺氧4.5h复方丹参滴丸组(培养液中浓度为0.049／L)；(3)缺氧10.5h组；(4)缺氧10.5h丹参滴丸组；(5)缺氧30min再给氧4h组；(6)缺氧30min再给氧4h丹参滴丸组；(7)缺氧30min再给氧10h组；(8)缺氧30min再给氧10h丹参滴丸组。 DSP干预组以DSP表示，无DSP组以No DSP表示。 4 免疫组织化学检测Fas／FasL蛋白表达 简要步骤：取出盖玻片，4℃丙酮固定5min。封闭，修复抗原，分别加入Fas,FasL抗体，IgG二抗，DAB显色，苏木素复染，封片。着棕黄色颗粒的细胞为阳性表达细胞。 5 图像分析 将玻片于光学显微镜下放大100倍，根据阳性细胞分布情况，每片选择5个视野，每个视野计数Fas／FasL蛋白阳性表达的细胞数，以平均计算阳性细胞数所占的百分比作为Fas／FasL蛋白阳性表达指数(PEI)。 6 统计学处理 所有数据均以均数±标淮差(? s)表示，组间两两比较用q检验。 结 果 1 缺氧4.5h组Fas／FasL蛋白表达的变化 着棕黄色颗粒的细胞为阳性表达细胞，每片选择5个视野，每个视野计数Fas／FasL蛋白阳性表达的细胞数，以平均计算阳性细胞数所占的百分比作为Fas／FasL蛋白阳性表达指数(PEI)。 缺氧组Fas／FasL蛋白凹PEI均显著大于对照组(p0.05)，丹参滴丸