植物体内过氧化物酶活性的测定描述.pptVIP

实验二 植物体内过氧化物酶活性的测定 实验目的 学习和掌握过氧化物酶(POD)活性测定的原理及方法。 背景知识 线粒体通过呼吸作用，一方面为细胞各项活动提供能量，另一方面也可通过呼吸链电子传递途径产生超氧阴离子，并通过链式反应形成对机体有损伤作用的活性氧。 活性氧（reactive oxygen species，ROS）是超氧阴离子（O2·–）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（·OH）和单线态氧（1O2）等几种分子的总称，其中O2·–和H2O2是所有活性氧的源头。 生物体内产生的活性氧若得不到及时清除，就会在细胞中积累，引起细胞凋亡。 抗氧化酶系统 生物体存在清除活性氧自由基的抗氧化酶系统，主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）3种酶类。；SOD能将线粒体产生的扩散到胞质中的O2·–转化成H2O2 ，而CAT和POD则能清除H2O2 。 过氧化物酶 过氧化物酶[peroxidase, POD]是广泛存在于各种动物、植物和微生物体内的一类氧化酶。催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧化反应: RH2+ H2O2 →2H2O + R。 重金属胁迫使活性氧自由基增多，膜脂过氧化加剧，其中SOD活性在一定范围内与细胞内的活性氧自由基水平呈正相关，而POD的活性则与植物体内重金属含量呈正相关。 实验原理 过氧化物酶能催化过氧化氢氧化酚类，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。 本实验是以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在该酶存在下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，其反应为： 该红棕色的物质在波长470nm处有最大光吸收，故可通过测470nm处的吸光度变化来测定过氧化物酶的活性。 实验材料、主要仪器和试剂 1．材料：萝卜叶片或根 2．仪器： （1）分光光度计；（2）天平； （3）离心机； （4）研钵 （5）刻度试管； （6）离心管等 3．试剂：(1) 20mM磷酸缓冲液(pH5.5) (2) 愈创木酚 (3) 30%H2O2溶液 实验材料的前处理 将实验材料分为三组，并将植物根系分别浸入浓度为0，6，12umol/L的CuSO4溶液中，处理时间为5小时。 操作步骤 1．酶液提取：称取0.5g白菜叶片于研钵中→加入2ml磷酸缓冲溶液→研成匀浆→转入10ml刻度试管中→再加3ml磷酸缓冲溶液冲洗研钵→转入10ml刻度试管中→以KH2PO4溶液定容 →再转入离心管中→4000r/min 4℃下离心15min →倾出上清液至刻度试管中→4℃下保存。 操作步骤 2. 取试管2只、1只加入3ml反应混合液，1m120mmol/lKH2PO4液作为对照；另1中加入3ml反应混合液，1ml酶液(若活性高则稀释之)，混匀后倒入比色皿中，于分光光度计上测定吸光度值，每隔30s读数一次，波长为470nm，至吸光值变化极微小后停止。 结果计算 ??以每分钟光密度（OD470nm）变化0.01为1个过氧化物酶活力单位，即： w:大麦苗鲜重 t：反应时间 D：稀释倍数，即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数 附注?? 酶的提取纯化需在低温下进行。 思考题 测定酶的活力要注意控制哪些条件？ （1）保持待测材料的酶活； （2）测定时注意控制反应时间；