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液相基础理论 一.高效液相的分类 高效液相的主要特点是：高速、高压、高效、高灵敏度。 高效液相的分类： 1.液-固色谱（吸附色谱） 2.液-液色谱：其特点是可通过单一的调整流动相和固定相，使分配系数有较大差异，以达到满意分离。液-液色谱又有正相和反相之分。所谓正相是指固定相为极性，而流动相为非极性；反相则相反。 3.离子交换色谱：它是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，由于离子对交换剂具有不同的亲和力而将他们分离。 4.凝胶渗透色谱：又名空间排阻色谱。它以凝胶为固定相，液体为流动相，当试样注入色谱柱后，分子量大的分子不能渗透到凝胶孔隙里去而受到排阻，因此首先被冲洗出来。小分子则可渗透到孔穴内部而最后被冲洗出来。 二．谱带扩张 谱带扩张即色谱峰变宽或变形，结果使柱效降低。引起谱带扩张的因素有柱内因素也有柱外因素。 1.柱外效应：产生这种扩张的主要原因是柱前和柱后死体积过大，组分分子在液相中的扩张系数α、流动相的流速慢等，其次是进样方式和检测器的响应时间等也会引起谱带扩张，因为进样器内存在一定的死体积，加上进样时液体的扰动，使试样在柱的顶端以截面的方式进入固定相，从而造成谱带扩张或不对称。 2.非瞬间平衡：混合物在流动相的携带下，在色谱柱中向前移动，与此同时，它们在固定相和流动相之间进行连续分配。由于每次分配都需要一定的时间，所以在流动相流动的状态下，分配平衡不可能瞬间平衡，其结果是谱带边缘被稀释，造成谱带扩张。 3.分子扩散：主要包括涡流扩散（由于柱中曲折的通道造成）、纵向扩散（由于柱中浓度剃度引起）、传质扩散（固定相传质阻力和流动相传质阻力）。 三．分离条件的选择指标 1.柱效能：由动力学因素所决定的色谱柱效率：用塔板板间距（H）或塔板数（n）表示。 2.分离度：将动力学和热力学参数综合考虑的色谱柱总分离效能指标，峰间距越大，峰越窄，分离度越大，效果越好。 四．装置 流动相存储器 高压泵，其基本要求是： 具有较高的输出压力 能使流动相以无脉冲的方式进入色谱柱 耐腐蚀性强 输送流动相的速度精确度要高，重复性要好，以得到可重复的分析结果 泵的死体积要小，以便于更换溶剂和剃度洗脱 梯度洗脱装置 进样系统：高压进样阀分为注射器和六通阀。用一特制的微量注射器将样品送入样品圈（定量管），然后将六通阀旋转60○，由高压泵输送的流动相将样品送入色谱柱。样品圈的容积是固定的，若进样体积超过样品圈的容积，多余的样品将经另一通路流入废液池。这种进样系统可以在40Mpa下迅速的、重复的将样品送入色谱柱。其缺点是系统管路太长，易产生色谱峰扩张。 色谱柱：高效液相色谱用的色谱柱大都采用内经为1-6mm的不锈钢管，柱长为10-50cm，柱形一般为直形柱。 检测器： 紫外检测器（UV）：紫外检测器是目前使用最广泛的检测器。它要求被分析组分必须吸收紫外光。这种检测器对温度和流量的变化不敏感，而对很多组分却有极高的灵敏度。现有的紫外检测器具有满刻度为0.005吸收单位的灵敏度和±1%的噪音。如此高的灵敏度不仅能检测吸收值较高的一些组分，甚至对具有中等紫外吸收的组分也可检测到几纳克数量级。其缺点是不能对那些没有紫外吸收的样品进行检测，溶剂的选用也受到一定的限制，对那些紫外光不透过的溶剂如苯则不能用作流动相。其结构主要分为光源、流动池（包括参比池和检测池）、紫外滤光片以及光敏检测器系统。光源主要有低压汞灯（波长固定在254nm）、氘灯（波长范围：195-400nm）、氘灯-钨灯（紫外-可见光任意波长）。使用紫外检测器对高效液相色谱中所用的溶剂（流动相组成）都有紫外光吸收，使用时要注意它们的吸收波长上限： 溶剂 吸收波长上限（nm） 溶剂 吸收波长上限（nm） 丙酮 330 烷基卤化物 225 芳香烃 300 四氢呋喃 220 四氯化碳 268 醚 220 乙酸乙酯 260 环己烷 215 氯仿 250 乙腈 190 二氯甲烷 245 烷烃 185 样品检测波长应当在溶剂吸收波长上限以上，才能保证检测的灵敏度。如果两者的吸收波长很接近，就应该换用吸收波长上限小的溶剂，或用其它类型的检测器。 示差折光检测器：示差折光检测器是一种浓度型通用检测器，它借助于连续检测样品池与参比池中液流间折射率的差值而达到测定试样浓度的目的。，其最大缺点是对温度变化非常敏感 荧光检测器（FLD）：它可检测那些用紫外光激发后能产生荧光的物质。 五．色谱固定相 载体的分类和特点：高效液相色谱中采用的载体有两类，即薄壳型和全多孔微粒型。 薄壳型：又名表面多孔型。它是在坚实无孔的玻璃珠表面上涂敷一层多孔的表面（如硅胶、氧化铝、离子交换树脂或聚酰胺等），这个多孔表面厚度为1-3um（核直径的1/30-1/40）。其特点是颗粒表面薄而