熒光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量.docVIP

荧光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量 实验目的 1、学习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的分析原理； 2、掌握荧光分光光度计的操作技术和测定多维葡萄糖粉中维生素B2的方法。 实验原理 光源→单色器→吸收池 ↓ If=2.303φI0εbc 单色器 ↓ 检测器 维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为： 维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。 维生素B2溶液在430～440 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535 nm。维生素B2在pH=6～7的溶液中荧光强度最大，在pH=11的碱性溶液中荧光消失，所以可以用荧光光度法测维生素B2的含量。 多维葡萄糖中含有维生素B1、B2、C、D2及葡萄糖，其中维生素C和葡萄糖在水溶液中不发荧光，维生素B1本身无荧光，在碱性溶液中用铁氰化钾氧化后才产生荧光，维生素D2用二氯乙酸处理后才有荧光，他们都不干扰维生素B2的测定。 维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。 970CRT荧光光度计 5 ml吸量管1只，2 ml吸量管1只， 50 ml容量瓶6只0 ml容量瓶只 10.0μg/ml维生素B2标准溶液，冰乙酸， 多维葡萄糖粉试样. （一）、970CRT荧光光度计基本操作： 1. 打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初始化仪器，预热30min 2. 仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数： 设置激发波长为440nm，发射波长为540 nm，灵敏度＝2，入射缝宽和出射缝宽均为10nm。 . 样品测定 1）、标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定： ? ??在个干净的50 ml容量瓶中，分别吸取0.50、1.00、1.50，2.00，2.50和3.00维生素B2标准溶液，各加入2.00 ml冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。得到不同浓度的溶液分别是：0.1，0.2，0.3，0.5，0.6/ml的维生素B2溶液，从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。 2）、未知试样的测定: 称取0g多维葡萄糖粉试样,用少量水溶解后转入 ml容量瓶中，加2.00 ml冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，平行测量其荧光强度3次、退出主程序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯。 1. 用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。 浓度(μg/ml) 1 2 3 平均值 3.3670 3.3880 3.4250 3.3933 0.1 8.4550 8.4920 8.4860 8.4776 0.2 13.3490 13.4390 13.4880 13.4253 0.3 18.5630 18.6410 18.6910 18.6316 0.4 23.4400 23.4380 23.4850 23.4543 0.5 28.2400 28.3050 28.4190 28.3213 0.6 ? 2、未知样品浓度的测定 根据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度，计算出试样中含量。 编号 1 2 3 平均值 IC/ug.ml-1 0.540 0.543 0.542 0.542 ? ? ? 维生素B2百分含量 =（0.*50.00）/(0.*106)*100%=0.00362% 注意事项 1.使用970CRT时，要按照仪器使用规定使用，不可随意操作 2.使用石英比色皿时，要注意勿用手直接触摸比色皿表面，因握住棱。 思考题 1. 试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因答：荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度，可成倍提高荧光强度。同时，提高仪器灵敏度，也可提高荧光光度法的灵敏度。而对于吸收光度法，无论是提高激发光强度提高仪器灵敏度还是提高仪器灵敏度，入射光和出射光同时增大，其灵敏度不变。因此，荧光光度法较吸收光度法灵敏度高 2. 维生素B2在pH＝6～7时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？ 答：因为维生素B2在碱性溶液中经光线照射，会发生分解而转化为光黄素，后者的荧光比核黄素的荧光强的多。因此，测量时溶液要控制在酸性范围内，且必须在避光条件下进行。