現代生化技术实验讲义(生物08).docVIP

实验一 牛乳中酪蛋白的提取及其含量测定 一、实验目的 1、掌握等电点法提取蛋白的基本原理及基本操作； 2、掌握双缩脲法测定蛋白含量的基本原理及基本操作。 二、实验原理 酪蛋白是乳蛋白质中最丰富的一类蛋白质，约占乳蛋白的80~82%，酪蛋白不是单一的蛋白质，是一类含磷的复合蛋白质混合物，以一磷酸酯键与苏氨酸及丝氨酸的羟基相结合。它还含有胱氨酸和蛋氨酸这两种含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。它在牛乳中的含量约为35g/L，比较稳定，利用这一性质，可以检测牛乳中是否掺假。 酪蛋白在其等电点时由于静电荷为零，同种电荷间的排斥作用消失，溶解度很低，利用这一性质，经牛乳调到pH4.6，酪蛋白就从牛乳中分离出来。酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中将脂类杂质除去。 在乳制品加工或成品中，酪蛋白含量是一个常需测定的指标。常用于测定酪蛋白的方法是先将酪蛋白在等电点沉淀，再用凯氏定氮法测定。本实验采用双缩脲法测定酪蛋白。其原理为：蛋白质含肽键，肽键在碱性溶液中可与铜离子形成紫红色化合物，在540nm波长处有最大吸收，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸组成无关。 三、材料与试剂 市售牛奶10mg/ml酪蛋白标准溶液（用0.1MNaOH配制）0.1M NaOH溶液、0.2M pH4.6的HAc－NaAc缓冲液 双缩脲试剂：称取硫酸铜（CuSO4·5H2O）1.5g，加水100ml，加热助溶；另称取酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）6.0g、碘化钾5g溶于500ml水中。两液混匀后，在搅拌下加入10%NaOH 300ml，后用水稀释至1000ml，贮存于塑料瓶中。此液可长期保存，若瓶底出现黑色沉淀则需重新配制。 四、操作步骤 1、牛乳中酪蛋白的等电点沉淀 用量筒量取25ml牛乳置50 ml 烧杯中，水浴加热至40℃，在搅拌下慢慢加入到已预热至40℃的等体积的0.2 M pH 4.6的HAc－NaAc缓冲液中，混匀，冷却静置30min沉淀酪蛋白后，3000r/min离心15 min，弃上清液，收集沉淀。 2、除杂 将上述沉淀捣碎，加入10 ml 95%乙醇，搅拌制成悬浮液。将此悬浮液倾于布氏漏斗中，抽滤除去乙醇溶液，再用10ml乙醚－乙醇混合液（1∶1）洗涤沉淀两次，最后再用10 ml乙醚洗涤沉淀两次，抽干。将沉淀从布氏漏斗中移去，在表面皿上摊开挥干乙醚后，称量（质量为m0）。称取挥干乙醚后的酪蛋白沉淀适量（质量为m1），置烘箱中80℃干燥过夜，称重（m2）。其余沉淀留作下步试验用。 3、酪蛋白产品纯度测定 （1）标准曲线的绘制 分别移取酪蛋白标准液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于干燥试管中，不足1.0ml者用0.1M NaOH溶液补足1.0ml，然后分别加入4.0ml双缩脲试剂，混匀，室温下反应30min，测定540nm波长处吸光度。以酪蛋白质量（mg）为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 （2）酪蛋白含量测定 称取“2步骤”中留取的沉淀适量（m3），用0.1M NaOH溶液溶解，配成10mg/ml样品溶液（体积为V ml）。取该溶液1.0ml，加入4.0ml双缩脲试剂，混匀，室温下反应30min，测定540nm波长处吸光度，查标准曲线，求得酪蛋白质量。平行测定3次，求其平均值（m4）。 五、结果与讨论 1、牛乳中酪蛋白含量的计算 含量（g/ml）= 2、酪蛋白产品纯度的计算 酪蛋白纯度= 六、思考题 1、为什么在等电点沉淀时需加热至40℃？ 2、除杂时，能否将三种溶剂的顺序颠倒？为什么？ 3、双缩脲法测定蛋白的原理是什么？ 实验二 大蒜细胞SOD酶的提取与分离 一、实验目的 1、掌握SOD酶的提取、分离、检测等一般步骤； 2、酶在提取过程中的两个参数：回收率和纯化倍数。 二、实验原理 超氧化物歧化酶（SOD）是一种就有抗氧化，抗衰老，抗辐射和消炎作用的药用酶。它可以催化超氧负离子（O-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：2O2-+H2→O2+H2O2.大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组合组织或者细胞破碎后，可用PH7.8的磷酸缓冲液体提取。由于SOD不溶于丙酮中，可用丙酮将其沉淀析出。 邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,在325nm有最大吸收峰。邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40s-3min这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。颜色深→SOD逐渐增多→颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。 三、试剂和材料 新鲜蒜瓣，市售 磷酸缓冲液：0.05 mol/L，pH7.8 氯仿一乙醇混合溶剂：氯仿﹕无水乙醇=3﹕5（V/V） 丙酮：用前冷却至4～10 ℃ 0.1mol/LTris—HCl缓冲液（pH=8.2,内含2mmol/LEDTA