現代生物技术思考题.docVIP

基因工程：又称基因克隆、DNA重组、 DNA克隆、分子克隆 1.概念：应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝，或其表达产物。 2.基因操作的四大要素 1、DNA重组技术：把不同来源的DNA片段切割、连接的方法； 2、载体克隆或表达技术：具有自我复制能力的适宜的载体，便于外源DNA片段的整合； 3、转化技术：把重组DNA导入细菌、酵母、植物或哺乳动物细胞的方法； 4、选择技术： 从细胞大群体中筛选出已经获得重组DNA片段的细胞的程序； 3.主要内容：分（离目的基因）、切（割目的基因和载体）、接（连目的基因和载体）、转（化宿主细胞）、筛（选阳性克隆）和表（达目的基因） 4.常用的工具酶： 限制性核酸内切酶 切割DNA DNA连接酶 生成3′- 5′磷酸二酯键 DNA聚合酶Ⅰ 探针标记、补平3′末端 反转录酶 cDNA合成 多聚核苷酸激酶 5′磷酸化、探针标记 末端转移酶 3′末端多聚尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 基因工程工具酶――限制酶、连接酶 一、限制酶 Restriction endonucleases ㈠ 生物体的限制-修饰系统 DNA Restriction-Modification System 限制修饰系统是一种存在于细菌（可能还有其他原核生物），可保护个体免于外来DNA（如噬菌体）侵入的系统。 一把特殊的剪刀—限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖 Arber研究噬菌体与细菌（A、B）的关系。 发现100-200个子代噬菌体中，只有1个可感染B，即其他的噬菌体在B中受到限制，唯有这一个受到修饰（甲基化）后感染成功。细菌B：在缺甲硫氨酸的培养基中，细菌死亡。 原因：细菌无法对自己的DNA进行修饰。 假设：限制性内切酶与修饰酶。 作用机理：有些细菌体内含有限制酶，可将双股DNA切断，再将切下的片段降解,因此能将入侵的外来DNA摧毁；有些病毒则演化出对抗此系统的机制,它们的DNA经过了甲基化或糖基化的修饰,可阻碍限制酶的作用；另外还有一些病毒，如T3及T7噬菌体，则合成出一些可抑制限制酶的蛋白质； 而为了进一步对抗病毒，有些细菌演化出专门辨识并切割已修饰DNA的限制系统。 限制酶：降解外源DNA，以保持遗传的稳定性； 修饰酶：识别自身DNA并将其甲基化，避免被自身限制酶降解；外源DNA偶而幸免被降解，使生物体产生小的变异。 限制性核酸内切酶的命名；一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。 例如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。 根据限制酶切割的特点，可将它们分为两大类：一类是切割部位无特异性的； 另一类是可特异性地识别核苷酸序列，即只能在一定的DNA序列上进行切割。 这种能被特异性识别的切割部位都具有回文序列，也就是在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。 限制酶识别序列的结构：限制酶识别的序列大多数为回文对称结构，切割位点在 DNA 两条链相对称的位置。 ? ?EcoRⅠ? ?G↓AATTC? ?? ?? ?? ?? ?? ?HindⅢ? ?A↓AGCTT? ?? ?? ?? ?? ?? ???CTTAA↑G? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?TTCGA↑A? ? ? ? 有一些限制酶识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干个任意碱基。如 AlwNⅠ 和 DdeⅠ ，它们的识别序列如下。? ?? ?AlwNⅠ? ?CAGNNNC↓TG? ?? ?? ?? ?? ? DdeⅠ? ?C↓TNAG? ?? ?? ?? ?? ?? ???GT↑CNNNGAC? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?GANT↑C 限制酶产生的末端 1．限制酶产生匹配粘端（matched ends）：识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为匹配粘端，亦即粘性末端，这样形成的两个末端是相同的，也是互补的。 ?NNG↓AATTCNN? ???EcoRⅠ? ?NNG? ? AATTCNN? ?NNCTTAA↑GNN? ?? ? NNCTTAA? ?? ?? ? GNN 2．限制酶产生平末端（Blunt end）??在回文对