生物藥物分离技术.docVIP

第二章 　表面活性剂分子在溶剂中缔合形成胶束的最低浓度即为临界胶束浓度 活性炭种类 颗粒大小 表面积 吸附力 吸附量 洗脱 粉末活性炭 小 大 大 大 难 颗粒活性炭 较小 较大 较小 较小 难 锦纶活性炭 大 小 小 小 易 大网格吸附树脂适合于提取各种有机化合物。优点（1） 选择性好（2） 解吸容易（3） 机械强度好（4） 流体阻力小（5） 反复使用 （6） 可适用于各种产品 硅胶是极性吸附剂,具有微酸性，适用于分离酸性和中性物质. 硅胶的活性与含水量有关：含水量高则吸附力减弱。当游离水含量17%以上时，吸附能力极低. 亲和吸附分离是利用溶质和吸附剂之间特殊的化学作用，从而实现分离。 吸附剂由载体（Carrier）和配位体(Ligand)组成 亲和吸附的特点：a 效率高：利用亲和吸附可以从粗提液中一次性分离得到高纯度的活性物质。 b 分离精度高：可用于分离含量极低，结构相近的化合物 c 通用性较差，洗脱条件苛刻 亲和吸附的载体通常是惰性的，往往不能直接与配基连接，偶联前需要先活化 载体经活化后，就可以进行与配基的偶联反应。 载体的活化:a溴化氰活化法：琼脂糖、葡聚糖引入亚氨基碳酸盐 b高碘酸活化法：氧化多糖，生成烷基胺 c环氧化法：多糖类载体与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物，再与氨基偶联 d甲苯磺酰氯法：双功能试剂法 二乙烯砜 配基偶联方法: 碳二亚胺缩合法(脱水) 酸酐法 叠氮化法 重氮化法 固相析出分离法 盐析：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程 盐析法机理：1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。 2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。 3）中和电荷，减少静电斥力，中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。 盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂 优点（1）价廉 ；（2）溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来（3）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好（4）不易引起蛋白质变性。 缺点：（1）水解变酸；2）高pH 释氨，腐蚀；3）残留产品有影响 影响盐析的因素：a溶质种类的影响：Ks和β值 b溶质浓度的影响：蛋白质浓度大，盐的用量小，但共沉作用明显，分辨率低；蛋白质浓度小，盐的用量大，分辨率高；c pH值：影响蛋白质表面净电荷的数量 通常调整体系pH值，使其在pI附近；d 盐析温度：一般在高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降 盐析法特点:1成本低，不需要特别昂贵的设备。2操作简单、安全。3不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得到保持生物活性的纯化蛋白质。4分离效果不理想，通常只是作为初步的分离纯化，还需要结合其它的纯化方法。 有机溶剂沉淀法: 在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。 优点：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易； 缺点：1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，2）操作要求在低温下进行。3）成本高 有机溶剂沉淀法机理: A 降低溶剂介电常数：减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了酶、蛋白质、核酸等带电粒子之间的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。B 破坏水化膜：有机溶剂与水互溶后，溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，降低蛋白质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白质沉淀。C 相反力：疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结合形成疏水层 沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇是最常用的沉淀剂. 乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析； 丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广 盐析法：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。 膜分离技术 膜分离方法: 透析, 微滤, 超滤, 纳滤, 反渗透, 电渗析, 渗透气化 过程 膜结构 驱动力 应用对象 实 例 微滤 对称微孔膜 0.05~10μm 压力差 消毒、澄清收集细胞 培养悬浮液除菌，产品消毒，细胞收集 超滤 不对称微孔膜 １~５0nm 压力差 大分子物质分离 蛋白质的分离/浓缩/纯化/脱盐/去热源 纳滤 复合膜＜1nm 压力差 Donna效应 小分子物质分离 糖/二价