一种简便的非放射性原位杂交法检测胰腺ⅱ型弹性蛋白酶mrna.docVIP

一种简便的非放射性原位杂交法检测胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mRNA 【摘要】nbsp; 　　目的 检测大鼠组织中胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mRNA的表达。方法 根据大鼠胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶基因序列合成两端含有相邻胸腺嘧啶结构的单链DNA探针，完成杂交后利用抗胸腺嘧啶二聚体抗体与抗原化的单链DNA探针进行反应，再运用免疫组织化学方法从而检出组织中目标mRNA的表达。结果 大鼠胰腺组织的外分泌腺细胞的细胞质被特异性染色，其他的组织细胞均显示阴性。结论 本试验中采用的原位杂交方法操作简便安全、无放射性，并且具有很高的灵敏度和特异性。实验结果提示大鼠胰腺外分泌腺细胞特异性表达胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mRNA，而其他组织细胞不表达。 【关键词】nbsp; 胸腺嘧啶二聚体；原位杂交；非放射性；弹性蛋白酶；mRNA nbsp;nbsp;nbsp; Abstract：Objective To detect the rat pancreatic elastase II mRNA in rats.Methods ISH was preformed by using Oligo-DNA probe based on the sequence of rat pancreatic elastase II mRNA,which 3 and 5 terminal conjugated with -A-T-T structure.The anti-T-T IgG antibody was used to react with haptenized Oligo-DNA in immunohistochemical process.Results Acinar cells in rat pancreas were highly labeled specifically by the probe.Conclusion It was a simple and safety ISH method with high sensitivity and specificity.The acinar cells in rat pancreas expressed pancreatic elastase Ⅱ mRNA specifically. nbsp;nbsp;nbsp; Key words:Thymine-Thymine dimer；ISH；non-radio；elastase；mRNA nbsp;nbsp;nbsp; 常常用的检测细胞基因表达的技术，已经发展出了很多方法，其中由小路武彦等学者利用胸腺嘧啶二聚体（thymine-thymine dimer，T-T dimer）特性近年来发展出一种无放射性原位杂交方法［1］，在此采用这种方法检测对大鼠组织中胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mRNA［2］的表达进行检测。 nbsp;nbsp;nbsp; 1nbsp; 原理 nbsp;nbsp;nbsp; 在生物细胞中有许多含有相邻胸腺嘧啶（thymine）序列的基因片段，当受到紫外线（包括阳光）照射时，任何两个相邻的胸腺嘧啶之间会形成共价键结构（即胸腺嘧啶二聚体），从而造成DNA片段的损伤。但由于T-T dimer具有半抗原的特性，所以可以利用这个特性而应用于ISH。当我们需要检测组织细胞中任何一段mRNA的表达时，可以设计并合成一段单链DNA引物（注意避免其中含有T-T构造），并在目标cDNA的两端链接上含有T-T构造的序列作为单链DNA探针。进行ISH时，用适当剂量的紫外光照射，使探针两端形成T-T dimer，将探针与mRNA杂交后，再使用抗T-T dimer的抗体与探针进行反应，那么运用简单的免疫组织化学技术即可检出组织细胞中目标mRNA的表达。 nbsp;nbsp;nbsp; 2nbsp; 方法 nbsp;nbsp;nbsp; 2.1nbsp; DNA探针的制备 nbsp;nbsp;nbsp; 合成的大鼠胰腺型弹性蛋白酶Ⅱ型的单链DNA片段序列为：tta-gtgccataacactcgaaaccgaggtgagacccga-att，序列为721～754（不包含3和5末端的-A-T-T序列）［2］。在ISH前用254 nm紫外线照射，能量为10kJ/m2。 nbsp;nbsp;nbsp; 2.2nbsp; 组织标本准备 nbsp;nbsp;nbsp; 在ISH中，组织标本的制作非常关键。用清洁磷酸缓冲液（PBS，pH7.4）配制的4%多聚甲醛对Wistar大鼠进行灌流固定过夜后，用PBS和含有30% (w/v)蔗糖和0.02% (v/v) DEPC的PBS冲洗并保存于4℃，组织取材后包埋于OCT中以制作冰