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乳腺肿瘤克隆性检测方法的比较 nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp; 作者：于琦, 牛昀, 丁秀敏, 于泳, 史玉荣, 肖绪祺nbsp;nbsp; 【关键词】nbsp; 乳腺肿瘤； 克隆性检测； 聚合酶链反应； 普通PCR； 巢式PCR 　　0nbsp; 引言 nbsp;nbsp;nbsp; 　　根据肿瘤的单克隆性，我们曾采用巢式PCR扩增DNA,用于研究乳腺癌癌前病变的早期诊断。我们将克隆性检测中所用聚合酶链反应的两种方法—普通PCR(GPCR)和巢式PCR(NPCR)的检测结果做一比较，以期找到更为简便、实用的方法。 　　1nbsp; 资料与方法 　　1.1nbsp; 临床资料 nbsp;nbsp;nbsp; 　　选择天津医科大学肿瘤医院乳腺病理室2000～2004年间存档的乳腺一般性增生（Usual ductal hyperplasia, UDH）和/外周型乳头状瘤（Peripapilloma, periPM）、不典型增生(Atypical ductal hyperplasia，ADH)和/periPM伴ADH及导管内癌 (Ductal carcinoma in situ, DCIS)石蜡包埋组织各30例，正常组织20例，均为女性，年龄19～72岁（中位49岁）。 　　1.2nbsp; 研究方法 　　1.2.1nbsp; GPCR反应nbsp; 按朱少君等[1]报告的方法，提取DNA，并取1μg，按反应体系（HhaⅠ内切酶1μl、10×M缓冲液2μl、牛血清蛋白0.2μl加灭菌水至20μl） 37℃消化3h，65℃ 20min终止反应，自然冷却。取消化后的DNA10μl，加Premix Taqnbsp; 25μl、引物AR1A和AR1B各2.2μl、加灭菌水至50μl反应体系（未经消化的DNA按以下公式换算：所加DNA（μl）=1/2消化时所需DNA（μl），再用灭菌水补足10μl）。按反应条件：97℃预变性7 min、94℃变性40s、56℃退火50s、72℃延长1min，共35个循环， 72℃延长15min。 　　1.2.2nbsp; NPCR反应nbsp; 取5μl GPCR扩增产物,用灭菌水稀释至500μl,然后取10μl稀释的DNA加引物AR2A和AR2B（反应体系同GPCR加至50μl）进行NPCR反应(反应条件同GPCR)。 AR1A：5’GAGGAGCTTTCCAGAATCTG 3’; AR1B：5’CATGGGCTTGGGGAGA 3’; AR2A：5’TCCAGAATCTGTTCCAGAGC 3’; AR2B：5’TGGGGAGAACCATCCTCACC 3’ 　　1.2.3nbsp; 琼脂糖凝胶电泳评价扩增效果，变性聚丙烯酰胺凝电泳，比较GPCR和NPCR的结果。 　　1.2.4nbsp; 统计学分析采用配对四格表χ2检验。 　　2nbsp; 结果 　　2.1nbsp; 琼脂糖凝胶电泳显示GPCR扩增条带清晰，与NPCR相同，见图1。 　　2.2nbsp; 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳比较扩增情况 nbsp;nbsp;nbsp; 　　正常组织、UDH和/ periPM酶切前后无明显变化，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在200bp与300bpDNA泳动位置间显示2条带，说明具有AR位点的多态性，是多克隆的；导管内癌组酶切后两条带中的1条明显减弱或消失，显示出Ｘ染色体失活嵌合性的丢失，属于单克隆性增生；在ADH和/periPM伴ADH样本中，一部分显示多克隆的，而一部分是单克隆的。分别用NPCR、GPCR扩增产物进行以上实验过程，并逐例比较经NPCR和GPCR后在电泳图上显示的带型。两种方法均扩增成功的样本电泳结果相似，显示扩增效果是一致的,见图2。 　　2.3nbsp; 各组样本GPCR和NPCR的扩增成功率比较nbsp; 见表1。 nbsp;nbsp;nbsp; 　　M：Marker； 1：normal breast tissue； 2：PeriPM；3和4： PeriPM伴ADH；5和6：DCIS 　　图1nbsp; 琼脂糖凝胶电泳图（略） nbsp;nbsp;nbsp; M是Marker,每相邻两个泳道如1和2、3和4、5和6、7和8是同一样本酶切前后的带型 　　图2nbsp; 经NPCR和GPCR扩增各组病变的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图 （略） 　　3nbsp; 讨论 nbsp;nbsp;nbsp; 　　最近10年,基于Ｘ染色体多态性为基础的克隆