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人Cyclin E原核表达载体的构建及表达 nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp; 作者：李珊, 潘全, 李云龙, 叶昕 【关键词】nbsp; Cyclin,E;,基因克隆;,原核表达 　　; 目的: 构建人Cyclin E基因原核表达载体, 并在E.coli BL21中表达并纯化。方法: PCR扩增人Cyclin E基因片段, 并将其克隆到原核表达载体pET32a(+)中, 构建重组质粒pET32a(+)Cyclin E。经限制性内切酶EcoR I 与Xho I双酶切鉴定及序列测定后, 转化E.coli BL21, 经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果: 获得全长约为1200 bp的人的Cyclin E基因片段。以构建的重组质粒pET32a(+)Cyclin E转化E.coli BL21后, 经IPTG诱导, 表达出相对分子质量（Mr）约60000的融合蛋白。经SDSPAGE、 Westernnbsp; blot分析显示, 诱导表达的蛋白为Cyclin E。结论: 成功地构建了表达载体pET32a(+)Cyclin E, 并表达出重组蛋白HisCyclin E, 为进一步筛选在体内外能与Cyclin E和CDK2结合的新蛋白奠定了基础。 　　[关键词]Cyclin E; 基因克隆; 原核表达 nbsp;nbsp;nbsp; 　　细胞周期是一个连续动态、 多阶段、 多因子参与的精确而有序的调控过程, 可分为5个时期: 即G0期、 G1期、 S期、 G2期、 M 期,nbsp; 有G1/S 限制点和G2/M两个限制点。在哺乳动物细胞周期的运行中, 有许多酶参与, 其中最核心的酶是由一组作为催化亚基的周期蛋白依赖激酶(CDK) 和一组作为调节亚基的周期蛋白(Cyclins) 组成的异二聚复合体[1], 两者结合后形成细胞周期调节复合物(cyclinCDK)并具有激酶活性, 能磷酸化细胞周期中相应的细胞因子以推进细胞周期的进行。在细胞周期蛋白中, Cyclin E属于G1期细胞周期的正调节因子, 参与G1/S转换点功能的调控, 与其他参与G1/S转换点功能调控的因子Cyclin DS、 抑癌基因视网膜神经胶质细胞瘤蛋白[2] (retinoblastoma protein, Rb)、 转录因子E2F、 抑癌基因p53、 KIP家族、 CDK2、 4、 5等相互作用共同决定细胞的生存和凋亡。而一旦细胞进入S 期Cyclin E即被泛素化降解。细胞周期调控是当前肿瘤学研究的热点, 细胞周期调控异常与肿瘤发生密切相关。为此, 我们构建人Cyclin E基因的原核表达载体, 并在E.coli BL21 中表达, 为今后发现并研究Cyclin E/Cdk2的新底物奠定了基础。 　　1nbsp; 材料和方法 　　1.1nbsp; 材料nbsp; EcoR I, Xho I, T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司。质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购自Tiangen公司。AntiRabbit IgG HRP 购自美国Promega公司。IPTG 购自Merk公司。DNA ladder由北京Tiangen公司提供。pDESTCyclin E载体、 pET32a(+)载体、 E.coli BL21、 及兔源antiCyclin E抗体, 由本实验室保存。 　　1.2nbsp; 方法 　　1.2.1nbsp; 人Cyclin E的PCR扩增nbsp; 根据Cyclin E的序列设计特异性引物, 将其从pDESTCyclin E载体上克隆。上游引物序列为: acgtgaattcatgaaggaggacggcggcgc; 下游引物的序列为: tagcctcgagtcacgccatttccggcccgctg, 其中下划线分别为EcoR I 与Xho I酶切位点, 引物均由北京英骏公司合成。PCR反应条件: 95℃ 5 min, 95℃ 1 min, 50℃ 45 s, 72℃ 1 min, 循环30次后, 72℃延伸5nbsp;nbsp; min。 　　1.2.2nbsp; 原核表达载体pET32a(+)Cyclin E的构建nbsp; 用EcoR I、 Xho I 分别酶切PCR产物与pET32a(+)质粒, 经琼脂糖凝胶回收, 将载体和目的片段用T4连接酶4℃连接过夜。 将连接的重组质粒pET32a(+)Cyclin E转化E.coli DH5α, 在含有50 mg/L氨苄的LB琼脂糖培养基中于37℃培养过夜。挑选阳性克隆, 扩增后提取质粒, 并用E