基因工程药物的分离纯化报告.ppt

第八节 基因工程药物的分离纯化 基因工程药物的分离、纯化非常重要。表达的产物都是多肽或蛋白质 。它的制得具有以下 特点： ①表达产物在初始料中含量较低； ②含有大量细胞及代谢产物； ③表达产物稳定性差，易失活变性； ④表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异； ⑤对其质量要求纯度高、无菌、无热原。 一、建立分离纯化工艺的根据 ⒈含目的产物的起始料的特点 基因工程菌的发酵产物其上游过程的各种因素对分离、纯化工艺有影响。包括： 　　①菌种的类型及其代谢特性。 　　②原材料培养基的来源及其质量。 　　③生产工艺及条件。 ⒉物料中杂质的种类和性质。 　　　⒊目的产物特性。 　　　⒋产品质量的要求 二 、分离纯化的基本过程 发酵液 细胞分离 胞内产物 胞外产物 细胞破碎 固液分离 浓缩 初步分离 高度纯化 制剂 产品 包含体 细胞碎片分离 变性 复性 三、分离纯化的技术 分离纯化的技术要求： ①技术条件温和能保持产物生物活性。 ②选择性好，能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离，达到较高的纯化倍数。 ③收率要高。 ④两个技数间能直接衔接， 不需要对物料加以处理。 ⑤纯化过程要快，满足高 生产率的要求。 ⒈细胞破碎与固液分离 ⑴细胞收集： 离心法、膜分离法。 ⑵细胞破碎：机械破碎法、非机械破碎法。 ⑶固液分离 ⒉目的产物的分离纯化 目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。 蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。 ⒉目的产物的分离纯化 目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。 蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。 产 物 特 性 　作 用 等电点 决定离子交换种类及条件 　相对分子量 选择不同孔径的介质 　疏水性 与疏水、反相介质结合的程度 　生物特异性 决定亲和配基 　溶解性 决定分离体系及蛋白浓度 　稳定性 决定工艺采用温度及流程时间 分离纯化的方法依赖色谱分离方法 ⑴离子交换层析（ ion exchange chromatography IEC） 离子交换层析的基本原理是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。 它具有分辨率高容量大操作容易，该法已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重要方法。 　　 ⑵反相色谱（reversed phase chromatography，RPC）和 疏水色谱（hydrophobic interaction chromatography，HIC） 反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质疏水性的差异来分离纯化的。 反相色谱是利用溶质分子中非极性基团与非极性固定相之间相互作用力的大小以及溶质分子中极性基团与流动相中极性分子之间在相反方向作用力的大小差异进行分离的。 常用固定相为硅胶烷基键合相。 流动相为低离子强度的酸性水溶液，加入能与水互溶的乙腈、甲醇、异丙醇等有机溶剂。 由于固定相骨架疏水性强，吸附的蛋白质需用有机溶剂才能洗脱下来。 疏水色谱的原理与反相色谱的原理相似，主要是利用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之间的相互作用，无机盐的存在能使相互作用力增强。 固定相介质表面的疏水性比反相色谱介质表面的疏水性弱。为有机聚合物键合相或大孔硅胶键合相。 流动相为pH6～8盐水溶液。 在高盐浓度时，蛋白质分子中疏水性部分与介子的疏水基团产生疏水性作用而被吸附；盐浓度降低时蛋白质疏水性作用减弱，目的蛋白质被逐步洗脱下来，蛋白质疏水性越强，洗脱时间越长。 与反相色谱相比，疏水色谱回收率较高，蛋白质变性可能性小。 ⑶亲和层析（affinity chromatography，AC） 亲和层析是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用。 配基：在亲和层析中起可逆性结 合的特异