第12章.重组DNA技术应用.ppt

定向改进：合理设计？如何对酶活进行设计， 着重于“量” 随机诱变与定向筛选技术： 有利基因突变信息、有利突变的组合信息、途径结构与控制方面重要信息，着重于“质” 反向代谢工程（有利突变点在野生菌株中的重新组装） 分子进化工程 基因或酶的人工定向进化: DNA Shuffling 基因或酶分子的合理设计：计算机上的模拟 不能把代谢工程与传统诱变与筛选技术割裂开来，代谢工程是开放、发展、不断自我完善的学科。 其“合成”方法已经不仅仅局限于重组DNA技术。 其“分析”方法已经成为代谢工程是否成功应用的决定因素。 分析方法: 基因测序、omics 分析、控制分析、动力学分析等等 细胞改良不能一蹴而就，需要代谢工程的反复循环应用。 代谢工程在很大程度上曾是应用分子生物学的技术体现，而很少带有工程方面的内容 代谢工程的一个特点是集中于整体代谢途径的分析而不是单个或少数几个反应。因此，代谢工程检验的是完整的生物化学反应网络，包括其途径合成和热力学可行性问题（反应是否可逆），以及途径的通量分布及其控制。 代谢工程的实质：将通量及其控制进行量化的方法与分子生物学技术结合起来，用以执行所建议的基因修饰任务。 代谢途径及其通量是代谢工程的核心。 代谢途径：一连串可以进行的并可观测的生物化学反应步骤，这些反应步骤被指定的一组反应物和产物所连结。 途径通量：反应物生成产物的速率。 胞内代谢通量的确定称为代谢通量分析(MFA)，其在代谢工程处于中心地位 代谢工程的应用 提高产物得率或生产率 扩大底物利用范围或降解有毒物质 构建新途径 扩展产物范围，增加新产品 改进细胞性能 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * 传统方法耗时更长，免疫反应有时缺乏合适的的抗体。 新方法：直接用可疑病原菌的核酸序列设计引物，进行杂交 * 人类遗传疾病的主要原因，一般结构基因内的发生氨基酸替换的SNP频率较小。 * 这种方法需要事先知道导致疾病的SNP序列或突变点 * M :探针杂交位点 基因内部没有导致限制性内切酶位点改变的突变，此时找离该基因最近的能导致内切酶位点改变的其它SNP位点 利用该位点酶切片段大小的影响进行鉴定：先鉴定父母携带突变致病基因的染色体位置，再确定胎儿基因型。 * 真核细胞中，编码基因也可能具有重复序列 亨廷顿舞蹈症是一种遗传神经退化疾病，主要病因是患者第四号染色体上的huntington基因发生变异，产生了变异的蛋白质，该蛋白质在细胞内逐渐聚集，形成大的分子团。科学家将这些不溶水的分子团称为“包涵体”。一般患者在中年发病，逐渐丧失说话、行动、思考和吞咽的能力，病情大约会持续发展15年到20年直到最后死亡，并最终导致患者死亡。这种病的遗传几率为50%。  正常的亨廷顿蛋白含有10-25段谷氨酰胺序列。但如果有36段以上的谷氨酰胺序列时，该蛋白质的形状即发生改变，并在神经元内形成大的丛群。 * 一般要通过以下几点来完成：1、将送检的各种生物学检样，如毛发、血痕、精斑、人体组织或白骨等，把其中所含的DNA 提取出来。2、选用与探针配对的限制性核酸内切酶，在长链DNA 位置上加以切割，使分子量很大的DNA 长链切短成许多长度不同的小片段。3、在胶板尺寸较长的凝胶电泳仪中，对酶解完全后的DNA 片段进行电泳，各酶切片段就会按其长度大小在电场中进行分离。4、先用碱性溶液使凝胶板中分离开的双链DNA 片段变性为单链片段，然后将凝胶板夹在尼龙膜中，使这些单链DNA 片段印溃(blot-ting)，转移并永久性地固定在尼龙膜上。5、让放射性DNA探针与尼龙膜上的单链DNA片段进行分子杂交。6、用放射性胶片与尼龙薄膜叠放，尼龙膜上的放射性探针便会发出X 射线使胶片曝光，从而使杂交有探针的长度不同的DNA片段位置显影在胶片上。这样的特征 DNA片段条状图谱，便是所谓的DNA指纹。单位点探针要选择保守性强的DNA区域，小卫星DNA的核心区域符合此要求。 * 亚单位疫苗不能增殖 重组细菌疫苗（通过基因工程技术破坏毒素基因，菌株毒性减弱或消失，仍能繁殖、触发免疫反应） * PL有三种可能：1.不含启动子的片段。2.含被小鼠细胞中物质诱导的启动子片段 。3.