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DHPLC技术在重大出生缺陷 基因诊断中的应用进展 刘敬忠 首都医科大学附属北京朝阳医院 基因诊疗中心 北京朝阳医院法医物证司法鉴定所 北京基因诊断实验室遗传病分部 出生缺陷包括各种单基因遗传病，多基因遗传病，染色体数目或结构异常引起的病，以及各种尚不明原因的先天性疾病等。重大出生缺陷的诊断、筛查及治疗已引起国家及全社会更进一步的高度重视。 DHPLC这一技术平台已经得到越来越多的应用。尤其是由于其能快速、简便地检测、筛查基因突变、SNP，包括已知的和未知的突变，因此正泛用于突变引起的多种单基因遗传病、癌症的研究,检测等等。 本人要重点介绍的是DHPLC另一类重要应用：就是应用于DNA片段大小的分析，和基因剂量或基因拷贝数检测、分析。这类检测并不需变性，而是在非变性条件下，运用离子对反相液相色谱原理，即可将长度不同的DNA片段分开，同时对每个产物峰进行定量测定，给出峰高或峰面积 用DHPLC分离分析不同大小的DNA，分析的精确度很高，一般来说DNA分子量的1%大小的区别能够分离开。例如100bp的DNA能与101bp的片段分开，300bp的DNA片段能与303bp的片段分成2个峰。仪器的软件（WAVE专用TM）能自动给出每个片段的bp数。在这种工作模式下，DHPLC可以用于PCR产物质量检测，纯化，不同大小片段的分离制备，STR多态性及连锁分析，微卫星不稳定性分析，以及与基因拷贝数分析有关的检测等。 。 用于基因剂量即基因拷贝数的定量分析：这种定量分析，不但要求仪器能将长短不同的DNA片段分离开，而且更为重要的是要求仪器能精确测出代表每个DNA片段峰的峰高和面积，并自动给出数据。DHPLC能够自动给出峰高、面积数据，并且精确度和重复性应该是较好的，因为本来HPLC主要功能就是可对被分析成分进行定量测定的。结合严格控制、优化mPCR循环数，即,使mPCR扩增反应停止在指数增长期，这样就可以使每个扩增产物峰高或面积直接反映各基因片段原始拷贝数。 这类检测的灵敏度也很高。通常以基因组DNA作mPCR的模板时，用紫外检测器就可以了。在被检测DNA模板浓度很低或DNA严重降解等情况下，可以采用荧光检测器对mPCR产物进行检测，后者检测灵敏度可提高近百倍。 唐氏综合征（D.S）即21-三体，18-三体及13-三体综合征，以及由于X,Y染色体数目异常导致的各种与性别、性功能、生殖能力有关的病，如Turners综合征（45X），部分克氏综合征（47,XXY,或49XXXY）, XXX综合征（47XXX，少数为48XXXX；49XXXXX等），XYY综合症（多数为47XYY，少数有48XYYY，或47XYY/45X）等。XYY综合症患者性格暴躁，易冲动，常有攻击性行为，容易走向犯罪道路。 上述三体综合症等的基因诊断，尤其是产前基因诊断，做为染色体核型分析诊断的一个辅助诊断技术，在临床检测中是很有需求的，它主要是在抽羊水后第二天就可以先给出一个是否D.S胎儿的检测结果，以缓解孕妇及家人在等待核型分析结果的二至三周时间中焦急不安的心情。 用DHPLC技术检测此类染色体数目异常，一般是在待检染色体上选定1-3个目标基因，例如在21染色体上选DSCR-3为目标基因，同时扩增12号染色体上的GAPDH基因作为参照基因，这一参照基因当然不应发生三体或缺失等情况，这样才能以它作为二条染色体的标准。合成引物，并优化上述单管二重PCR反应条件及热循环次数后，行DHPLC分析。每次进样量为15ul，非变性，离子对反向条件洗脱，柱温50℃。检测器采用紫外检测器。检测出D.S患者DNA的DSCR-3基因峰高显著高于正常DNA标本。经计算，其基因拷贝数平均值确实高了。 计算公式如下： DSCR-3峰高（U） GAPDH峰高（U） 目标基因拷贝数= ÷ ×2 DSCR-3峰高（N） GAPDH峰高（N） U：待测未知标本 N：正常对照标本 用类似的原理和方法，还可以用DHPLC检测基因的缺失和重复，尤其是此类缺失或重复导致的疾病的携带者，不容易用其它技术鉴别出来，而用DHPLC技术可通过定量检测携带者总的基因拷贝数的变化而得以鉴别。Dr.Hung ,Su等于2005年就报道了他们区分DMD携带者和非携带者的工作。 Dehainault等用mp/DHPLC技术正确检测出了121例视网膜母细胞病患者RB1基因的所有外显子的缺失，还查出了一个以前未被查出的RB1重复。 新近，Dr.Hung、苏等报道了其运用该项技术